Zusammenfassung
Ceramid ist das zentrale Molekül im Sphingomyelin-Zyklus. Es wirkt als intrazellulärer Botenstoff (Second Messenger) und bewirkt Proliferationshemmung, Apoptose und Induktion der Differenzierung als zelluläre Antwort [Geilen et al., 1997a].
In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirkung von Ceramid auf Proliferation, Apoptose und Expression Apoptose-assoziierter Gene in humanen Keratinozyten in serumfreiem Medium untersucht. Da natürliche langkettige Ceramide nur schwer in die Zelle gelangen können, wurden kurzkettige Ceramid-Analoga verwendet. Diese sind menbrangängig und verursachen in der Zelle die gleiche biologische Wirkung wie ein Anstieg von natürlichem intrazellulären Ceramid. Als Zellkulturmodell diente die humane Keratinozytenzellinie HaCaT.
Zuerst wurde die Wirkung des Ceramid-Analogons C2-Ceramid auf Proliferation und Apoptose in HaCaT-Zellen in serumfreiem Medium untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß C2-Ceramid in HaCaT-Zellen konzentrationsabhängig antiproliferativ ist und Apoptose induziert. Gleichzeitig wurde demonstriert, daß das in der Literatur als biologisch inaktiv beschriebene Ceramid-Analogon Dihydroceramid ebenfalls, wenn auch in viel geringerem Maße als C2-Ceramid, antiproliferativ und apoptotisch in HaCaT-Zellen wirkt und deshalb nur eingeschränkt in diesem System als Negativkontrolle verwendet werden kann.
Im Folgenden wurde der Effekt von C2-Ceramid (30 µmol/l) auf die Expression verschiedener Apoptose-assoziierter Gene mittels RT-PCR untersucht.
Proteine wie das pro-apoptotische Bax und das anti-apoptotische Bcl-2 spielen in der Apoptose auf mitochondrialer Ebene eine zentrale Rolle. Obwohl eine geringe Erhöhung der bcl-2-Expression bei gleichbleibender bax-Expression gemessen werden konnte, verhinderte dies nicht die Ceramid-induzierte Apoptose.
Veränderungen der Expression von p53, einem Gen, das an der Kontrolle des Zellzyklus beteiligt ist, konnten nicht gemessen werden.
Die Expression von c-myc, das als Transkriptionsfaktor ebenfalls in den Zellzyklus eingreift, war zu allen drei Meßzeitpunkten geringfügig erhöht.
Deutliche Ceramid-induzierte Genexpressionsänderungen waren bei den Genen c-jun und c-fos zu verzeichnen. Ihre Genprodukte bilden zusammen den Transkriptionsfaktor AP-1. Innerhalb von 24 h stieg die Expression von c-jun bis auf das 5 fache der Kontrollen an. Die Expression von c-fos verhielt sich dazu entgegengesetzt und sank nach 24 h bis unter die Hälfte gegenüber den Kontrollen. Dies macht deutlich, daß eher c-Jun und nicht c-Fos an der Bildung des Transkriptionsfaktors AP-1 in diesem System beteiligt ist.
Um die Hinweise auf eine Ceramid-vermittelte Induktion von AP-1 zu bestätigen, wurde die Bildung und Aktivität von AP-1 mittels eines Transaktivierungsassays verifiziert. Die AP-1-Aktivität wurde nach 24stündiger Inkubation mit C2-Ceramid auf das 8 fache der Kontrollen induziert. Auf diese Weise konnte die Beteiligung des Transkriptionsfaktors AP-1 an der Ceramid-induzierten Apoptose auf funktioneller Ebene sowie an der Expression Differenzierungs- und Apoptose-assoziierter Gene in Säugern bestätigt werden. Damit wurde im Rahmen dieser Arbeit eine erste direkte Verbindung zwischen einem intrazellulären Ceramidanstieg und der Zellproliferationshemmung und Einleitung der Apoptose gefunden. Diese Verbindung schließt die Signalkaskade zwischen der antiproliferativen und apoptotischen Wirkung von Vitamin D3 auf Keratinozyten, die wir kürzlich nachweisen konnten [Geilen et al., 1997b]. Es ergibt sich folgendes Bild:
1?,25-Dihyroxyvitamin D3 -> TNF? -> Ceramid -> AP-1 -> Hemmung der Zellproliferation und Einleitung der Apoptose. |
