Zusammenfassung
Die funktionelle Analyse der Proteine, die in bestimmten Geweben und/oder Entwicklungsstadien exprimiert werden, ist unverzichtbar für das Verständnis biologischer Vorgänge. Bis heute steht keine Technik zur Verfügung, um direkt von Sequenzinformation individueller cDNA Klone zu den Proteinprodukten zu gelangen. Bei der hier beschriebenen Vorgehensweise wurden geordnete cDNA Expressionsbanken aus humanem Fötalgewebe (hEx1) und Maus Nierengewebe (mKd1) hergestellt, um experimentelle Daten, die auf DNA-Basis oder Proteinbasis gewonnen wurden, integrieren zu können. Ein E. coli Plasmidvektor (pQE30NST) für die Expression His6-markierter Fusionsproteine wurde für die Klonierung von cDNA benutzt, die mit einem oligo(dT) Primer synthetisiert wurde. 27.600 Klone der mKd1 und 193.000 Klone der hEx1 Bank wurden mit Hilfe von Robotern gepickt, in Mikrotiterplatten wachsen gelassen und auf Membranfiltern mit einer Dichte von 9.216 oder 27.648 Klonen pro Filtern angeordnet. Hochdichte-DNA und Proteinfilter wurden auf diese Art hergestellt und für das parallele Screening der cDNA-Banken mit DNA-Sonden und Antikörpern benutzt. Ein Antikörper gegen die N-terminale Sequenz RGSH6 von Proteinen, die mit dem pQE30NST Vektor exprimiert wurden, wurde benutzt, um Expressionsklone zu identifizieren. Ungefähr 20% der Klone der mKd1 und hEx1 cDNA Banken wurden durch diesen Antikörper als mutmaßliche Expressionsklone identifiziert. 37.830 mutmaßliche Expressionsklone der hEx1 cDNA-Bank wurden zusammengefaßt und neu in Mikrotiterplatten angeordnet. Eine Kopie dieser neuen cDNA-Bank wurde dem Ressourcenzentrum im Deutschen Humangenomprojekt (RZPD, http://www.rzpd.de) für die Herstellung und Verteilung von Hoch-Dichte DNA- und Proteinfiltern gegeben. Die Expressionsprodukte und DNA-Sequenzen von 96 zufällig ausgewählten Klonen wurden analysiert. Zu diesem Zweck wurde die Expression und Reinigung von Proteinen in Mikrotiterplatten etabliert. 68 von 96 Klonen exprimierte Proteine von mindestens 15 kd Größe (bestimmt durch SDS-Gelelektrophorese), die nach SDS-Gelelektrophorese von Gesamtzellproteinen oder nach Metall-Affinitätschromatographie nachgewiesen wurden. cDNA-Inserts von 93 Klonen wurden vom 5´-Ende her ansequenziert. 58 dieser Sequenzen entsprachen Proteinsequenzen in der SWISS-PROT und TrEMBL Datenbank. 38 (66%) dieser 58 Sequenzen enthielten Inserts, die im richtigen Leseraster kloniert waren, d.h. die His6-Sequenz auf dem Vektor und eine Protein-kodierende cDNA Sequenz waren im richtigen Leseraster fusioniert. 66% war der Anteil der Sequenzen, die mit dem Anfang einer Proteinsequenz übereinstimmten, und von denen deshalb angenommen wurde, daß sie eine vollständige Protein-kodierende Sequenz enthalten („full-length Klone").
In der hEx1 Bibliothek wurden Expressionsklone für eine Auswahl menschlicher Gene identifiziert. Neun cDNA-Sonden für BMP-7, Calmodulin, COX4, GAPDH, hMSH2, HSP90a, HSP90b, RXRb und VDAC1 wurden für DNA-Hybridisierungs-Screenings benutzt. Unter den positiven Klonen wurden solche Klone, die auch durch den RGS·His-Antikörper detektiert wurden, als mutmaßliche Expressionsklone betrachtet. Expressionsklone für sieben Gene, jedoch nicht für BMP-7 und VDAC1, wurden so gefunden. Biologische Aktivität von His6-GAPDH und Calmodulin Fusionsproteinen wurde durch Enzym-Assays nachgewiesen. DNA-Sonden und der RGS·His Antikörper wurden in Kombination eingesetzt, um Klone zu identifizieren, die GAPDH und HSP90a Fusionsproteine exprimieren. Parallel dazu wurden spezifische Antikörper gegen GAPDH und HSP90a eingesetzt, um Expressionsklone auf Hochdichte-Proteinfiltern zu identifizieren. Alle Klone, die von den Protein-spezifischen Antikörper erkannt wurden und His6-GAPDH oder HSP90a Fusionsproteine exprimierten, wurde auch von dem RGS·His Antikörpern erkannt. Der RGS·His Antikörper detektierte weitere Klone, die GAPDH oder HSP90a Inserts enthielten, die entweder nicht im richtigen Leseraster kloniert waren, oder bei denen es sich um Teilsequenzen handelte, die nicht die von den Protein-spezifischen Antikörper erkannten Epitope umfaßten. Ungefähr 90% der Klone mit Inserts, die nicht im richtigen Leseraster kloniert waren, wurden durch den RGS·His Antikörper nicht erkannt.
Ein Protokoll für die Analyse von His6-Fusionsproteinen durch matrix assisted laser ionisation/desorption Massenspektrometrie (MALDI-MS) wurde etabliert. His6-Fusionsproteine wurden auf Ni2+-Chelator-beschichteten magnetisierbaren Partikeln immobilisiert und so unter denaturierenden Bedingungen gereinigt und direkt mit Trypsin verdaut. Die Massen der tryptischen Peptide wurden gemessen und mit vorhergesagten Massen aus Sequenzdatenbanken verglichen.
Die Verwendung von geordneten cDNA Expressionsbanken erweitert die Anwendung von geordneten DNA-Banken auf Protein-basierende Screening-Methoden, und schafft so eine direkte Verbindung zwischen experimentellen Daten, die auf DNA- und Proteinbasis gewonnen werden. Die hEx1 Expressionbank ermöglicht eine schelle Identifikation von Expressionsklonen für bestimmte Gene durch Screening mit DNA-Hybridisierungs-Sonden oder Antikörpern. Die Protein-Produkte von Klonen der cDNA-Bank können direkt für funktionelle Assays verwendet werden, oder können, falls inclusion bodies gebildet werden, als Antigene für die Produktion von Antikörpern verwendet oder möglicherweise in vitro gefaltet werden. Bibliotheken aus Expressionsklonen könnten, in Kombination mit Protein-Expression und -Reinigung in Mikrotiterplatten mit hohem Durchsatz, einen sinnvollen Weg zur Herstellung von Gen-Produkt-Katalogen darstellen.
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