DARWIN Digitale Dissertationen English Version Strich

FU Berlin
Digitale Dissertation

Stefan Wagner :
Untersuchungen zur subzellulären Verteilung von Proteinkinase C
Investigations on protein kinase C´s subcellular distribution

 FU Logo

|Zusammenfassung| |Inhaltsverzeichnis| |Ergänzende Angaben|

Zusammenfassung

Proteinkinase C (PKC) ist eine Gruppe von Serin/Threonin Kinasen mit wichtigen Funktionen in vielen Signaltransduktionsprozessen. Eine besondere Rolle bei der Wahrnehmung der spezifischen Funktionen der PKC Isoformen nimmt die subzelluläre Veteilung ein, die sich häufig nach PKC-Aktivierung verändert. Zur Untersuchung der subzellulären Verteilung von PKCa unter besonderer Berücksichtigung der Kerntranslokation verwendete ich Fusionsproteine bestehend aus PKCa und dem green fluorescent protein (GFP).
Im Rahmen der Arbeit wurden zunächst neben PKCa Fusionsproteine aus Gluthathion-S-Transferase und PKCa (GST-His6-PKCa) sowie GFP und PKCa (GFP-PKCa) in Sf9-Insektenzellen hergestellt. Mit Hilfe eines Aktivitätstests wurde anschließend gezeigt, daß es sich dabei um katalytisch aktive Proteine handelt. Das Anfügen von GST-His6 und GFP an PKCa hat offensichtlich keinen Einfluß auf die Aktivität, da sich die Fusionsproteine in ihrer Aktivität nicht von PKCa unterscheiden.
Gereinigtes GFP-PKCa aus den Insektenzellen transloziert wie endogene PKCa in Digitonin-permeabilisierten NIH 3T3-Fibroblasten in den Zellkern. Die Translokation beruht nicht auf simpler Diffusion, verläuft jedoch anscheinend ohne Cofaktoren . Da man bei Präinkubation mit dem Cytosolersatz Retikulozytenlysat eine Abschwächung des Kerntransports beobachtet, gibt es im Retikulozytenlysat wahrscheinlich einen Retentionsfaktor, der GFP-PKCa im Cytoplasma festhält. Permeabilisierung scheint ein generell es Signal für PKCa-Kerntransport zu sein, da GFP-PKCa auch in transfizierten permeabilisierten Zellen einer Kerntranslokation unterliegt.
Die Expression von PKCa und den Fusionsproteinen GFP-PKCa und PKCa-GFP in transfizierten NIH 3T3-Fibroblasten bewirkt überraschenderweise eine Veränderung der Lokalisation verglichen mit endogener PKC a. Während endogene PKCa nach PMA-Aktivierung in den Zellkern transloziert, findet man überexprimierte aktivierte PKCa sowie GFP-PKCa und PKCa-GFP hauptsächlich an der Plasmamembran. Die Verschiebung zur Plasmamembran ist wahrscheinlich auf die Überexpression, nicht jedoch auf die Fusion von GFP an PKCa zurückzuführen.
Untersuchungen mit GFP-PKCa-Deletionsmutanten deuten auf eine aktive Beteiligung der ersten 187 Aminosäuren an der Kerntranslokation von PKCa hin. Die katalytische Domäne scheint dagegen keine direkte Rolle beim Kerntransport zu spielen. Der Abschnitt zwischen den Aminosäuren 252 und 289 und die V5-Region am C-Terminus haben vermutlich eine negative regulatorische Funktion beim Kerntransport von PKCa.

Inhaltsverzeichnis

Die gesamte Dissertation können Sie als gezippten tar-File oder als zip-File laden.

Durch Anklicken der Kapitelüberschriften können Sie das Kapitel in PDF-Format laden:

Inhaltsverzeichnis
1.Einleitung 1
1.1. Kernhülle und Kernporenkomplexe 1
1.2. Transport vom Cytoplasma in den Kern 2
1.3. Proteinkinase C 4
1.4. Das grün fluoreszierende Protein (green fluorescent protein, GFP) 11
1.5. Zielsetzung der Arbeit 15
2. Ergebnisse 16
2.1. Expression verschiedener PKCa´s in Insektenzellen 16
2.2. In vitro Transporttest mit GFP-PKCa 19
2.3. Digitonin-Permeabilisierung transfizierter NIH 3T3-Fibroblasten 23
2.4. Subzelluläre Veteilung in transfizierten NIH 3T3-Fibroblasten 24
2.5. Subzelluläre Veteilung von GFP-PKCa in transfizierten Cos-7-, CHO- und Neuro 2a-Zellen 38
3. Diskussion 40
3.1. Expression in Sf9-Insektenzellen 40
3.2. Digitonin-Permebilisierung transfizierter NIH 3T3-Fibroblasten 41
3.3. Subzelluläre Verteilung von GFP-PKCa-Fusionsproteinen 42
3.4. Subzelluläre Verteilung von GFP-PKCa-Punktmutanten 43
3.5. Untersuchungen zu Kernlokalisationssequenzen von PKCa 44
3.6. Modell für die Kerntranslokation von Proteinkinase Ca 46
3.7. Zusammenfassung und Ausblick 48
3.8. Summary 50
4. Material & Methoden 51
4.1. Zellkultur 51
4.2. Proteinexpression in E. coli 54
4.3. Proteinreinigung 55
4.4. PKC-Aktivitätstest 57
4.5. In vitro Transporttest 58
4.6. Protein-Bestimmung 60
4.7. Gelelektrophorese von Proteinen 60
4.8. Western Blot 61
4.9. Fluoreszenzmikroskopie 62
4.10. Molekularbiologische Methoden 63
5. Literatur 72
6. Anhang 82
6.1. Lebenslauf 82
6.2. Veröffentlichungen 83
6.3. Danksagungen 84
6.4. Abkürzungen 85

Ergänzende Angaben:

Online-Adresse: http://www.diss.fu-berlin.de/1999/58/index.html
Sprache: Deutsch
Keywords: protein kinase C, nucleus, plasma membrane, green fluorescent protein
DNB-Sachgruppe: 30 Chemie
Datum der Disputation: 07-Oct-1999
Entstanden am: Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie, Freie Universität Berlin
Erster Gutachter: Prof. Dr. F. Hucho
Zweiter Gutachter: Prof. Dr. G. Schultz
Kontakt (Verfasser): srw@chemie.fu-berlin.de
Kontakt (Betreuer): klabuch@chemie.fu-berlin.de
Abgabedatum:13-Oct-1999
Freigabedatum:24-Aug-2000

 

|| DARWIN|| Digitale Dissertationen || Dissertation|| English Version|| FU Berlin|| Seitenanfang ||

Mail-Icon Fragen und Kommentare an:
darwin@inf.fu-berlin.de

© Freie Universität Berlin 1999