FU Berlin Digitale Dissertation
Carola Burgtorf : Molekulare und genetische Analyse komplexer Genome Molecular and genetic analysis of complex genomes
|Zusammenfassung| |Inhaltsverzeichnis| |Ergänzende Angaben|

Zusammenfassung Innerhalb dieser Doktorarbeit wurden verschiedene Aspekte der Analyse komplexer Genome untersucht. Zunächst wurde die Anwendbarkeit verschiedener, auf Hybridisierung beruhender Techniken für das genetische Kartieren in den Genomen von Zebra- und Medakafisch getestet. Diese sollten ein effizientes Kartieren mit einer hohen genetischen Auflösung erlauben. Die einfachste Möglichkeit Marker zu generieren, die durch Hybridisierung kartiert werden können, ist die IRS-PCR. Diese PCR-Technik nutzt die im Genom eingestreuten repetitiven Elemente aus, um die nicht repetitive Frakton des Genoms zu amplifizieren, die zwischen zwei dieser Elemente liegt. Dieses komplexe PCR-Produkt wurde kloniert und etwa 1000 individuelle Klone einer rund 16.000 Klone umfassenden Marker-Bibliothek wurden auf kleine ´Southern´-blots hybridisiert, die IRS-PCR-Produkte verschiedener Zebrafischstämme enthielten. Die Klone, die auf den Southernblots einen +/- -Polymorphismus zeigten, wurden anschließend auf "Kartierungsfilter" hybridisiert, die IRS-PCR-Produkte von vier verschiedenen Kreuzungen enthielten. Bei dieser Vorgehensweise traten zwei Schwierigkeiten auf: Zum einen wurden aufgrund einer gewissen Redundanz der Marker-Bank wiederholt die gleichen Klone analysiert. Dieses Problem konnte teilweise gelöst werden, indem die gesamten Marker-Bank durch ´Oligo-fingerprinting´ analysiert wurde, und Klone mit ähnlichen ´fingerprints´ in Clustern zusammengefaßt, und dann repräsentative Klone verschiedener Cluster untersucht wurden. Das größere Problem war jedoch der hohe Grad an Variabilität innerhalb der Zebrafisch-Stämme, so daß schließlich nur 30% der Marker, die zuvor als polymorph identifiziert wurden, auf der Karte plaziert werden konnten. Insgesamt konnten aber dennoch rund 80 verschiedene Marker auf einer der Referenz-Kreuzungen ausgewertet werden, und 50 davon zeigten genetische Kopplung zu wenigstens einem weiteren Marker. Im Medakafisch wurde diese Strategie ebenfalls, jedoch mit einer Kombination von Primern, die für drei verschiedene repetitive Elemente komplementär sind, getestet. Aus der 3800 Klone umfassenden Marker-Bank wurden hundert potentielle Marker auf Southern blots getestet. Die Rate an polymorphen Markern lag mit 30 % mehr als doppelt so hoch wie im Zebrafisch. Darüber hinaus waren 50 % der als polymorph identifizierten Marker auch auf einer F2-Kreuzung zweier verschiedener Populationen polymorph. Dies zeigt, daß im Medakafisch die Stämme genetisch gut getrennt und innerhalb eines Stammes relativ homozygot sind. Um weitere genetische Marker zu finden, die außerdem eine gleichzeitige Verknüpfung von genetischen Kartierungsdaten und genomischen Klonen erlaubten, wurde für den Medakafisch eine modifizierte AFLP-Methode entwickelt. Nach Hybridisierung von Amplikons, die aus zwei verschiedenen Medakafischstämmen generiert wurden, auf eine Cosmid-Bank, wurden 80 Klone isoliert, die ein differentielles Hybridisierungsmuster aufwiesen. Aus 20 % der so identifizierten Cosmide ließ sich eine Probe isolieren, die sich auf einer F2-Geschwister-Kreuzung kartieren ließ. Ein weiterer Aspekt bei der Untersuchung komplexer Genome ist die vergleichende Sequenzanalyse. Dadurch können Einblicke in Genomevolution und -organisation gewonnen werden. Innerhalb dieser Arbeit wurde ein 40 kb großer Klon aus einer Amphioxus-Cosmid-Bank sequenziert, mit verschiedenen Exon-Vorhersage-Programmen (Grail, GenScan, Mzef) untersucht und mit zwei öffentlichen (Genbank, Swissprot) und einer internen (Amphioxus-EST) Sequenzdatenbanken verglichen. Dabei konnte unter anderem ein Gen der Aldo-Keto-Reduktase-Familie identifiziert werden. Es konnte ferner gezeigt werden, daß sich genomische Sequenzanalyse und EST-Projekte komplementieren.

Inhaltsverzeichnis Die gesamte Dissertation können Sie als gezippten tar-File oder als zip-File laden. Durch Anklicken der Kapitelüberschriften können Sie das Kapitel in PDF-Format laden: Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1. Einleitung 1.1. Modell Organismen 1.1.1. Der Zebrafisch 1.1.2. Der Medakafisch 1.1.3. Der Fugufisch 1.1.4. Lanzettfisch 1.2. Isolierung und Analyse von Genen 1.2.1. Mutagenese-Screen 1.2.2. Genetisches Kartieren 1.2.3. Physikalisches Kartieren 1.2.4. Sequenzanalyse 2. Material und Methoden 2.1. Materialien und Chemikalien 2.1.1. Chemikalien 2.1.2. Enzyme 2.1.3. Molekulargewichtsstandards 2.1.4. Oligonukleotide 2.1.5. Klonierungsvektoren 2.1.6. E. coli-Stämme, Zellinien und Fische 2.2. Häufig verwendete Lösungen 2.3. Medien und Zellkultur 2.3.1. Bakterienmedien und Zellkultur 2.3.2. Zebrafisch Zellkultur 2.4. Experimentelle Methoden 2.4.1. Nukleinsäure-Extraktionsprotokolle 2.4.2. DNA Manipulationen 2.4.3. Subtraktive Klonierung 2.4.4. Klonierungsverfahren 2.4.5. Elektrophorese 2.4.6. Hybridisierungstechniken 2.4.7. PCR Techniken 2.4.8. Haploide Zebrafisch Embryos 2.5. Daten-Analyse 2.5.1. Sequenz-Analyse 2.5.2. Kopplungs-Analyse 3. Ergebnisse 3.1. Genetisches Kartieren im Zebrafisch 3.1.1. Identifikation polymorpher Zebrafischstämme 3.1.2. Testen der verschiedenen repetitiven Elemente auf ihre Tauglichkeit für IRS-PCR 3.1.3. Verteilung der ´mermaid´ Elemente im Zebrafisch-Genom 3.1.4. Abschätzung der Häufigkeit der ´mermaid´-Elemente im Genom 3.1.5. Konstruktion der ´inter-mermaid´-Marker-Banken 3.1.6. Charkterisierung der ´inter-mermaid´-Marker-Banken 3.1.7. Identifikation polymorpher Klone in den Marker-Banken 3.1.8. Hybridisierung der polymorphen Klone auf Kartierungsfilter 3.1.9. Integration von genetischer, cytogenetischer und physikalischer Karte 3.1.10. Testen der Repräsentativen Differenz Analyse (RDA) als alternative Strategie 3.2. Genetisches Kartieren im Medakafisch 3.2.1. IRS-PCR-Strategie 3.2.2. Analyse mittels AFLP-Hybridisierung 3.3. Analyse eines Amphioxus Cosmids 3.3.1. Cosmidbank 3.3.2. Sequenzanlyse 3.3.3. Gen-Inhalt des Amphioxuscosmids MPMGc117B0533 3.3.4. Repetitive Elemente innerhalb des Amphioxuscosmids MPMGc117B0533 4. Diskussion 4.1. Wahl der Organismen 4.2. Genetische Kartierung im Zebrafisch 4.2.1. Wahl der ´Stämme´ für das Kartierungs-Panel 4.2.2. IRS-PCR-Strategie 4.2.3. Identifikation polymorpher Klone in den Markerbanken 4.2.4. Kopplungsanalyse 4.2.5. Integration von genetischer und physikalischer Karte 4.2.6. Alternative Hybridisierungsstrategie - RDA 4.2.7. Abschließende Bewertung und Ausblick 4.3. Genetische Kartierung im Medaka 4.3.1. IRS-PCR im Medaka 4.3.2. Anwendung einer modifizierten AFLP-Strategie im Medaka 4.3.3. Abschließende Beurteilung und Ausblick 4.4. Analyse eines Amphioxus Cosmids 4.4.1. Bedeutung des Amphioxusgenoms für die Analyse des Vertebratengenoms 4.4.2. Basenzusammensetzung des Cosmids 4.4.3. Gengehalt des Amphioxuscosmids 4.4.4. Repetitive Elemente innerhalb des Amphioxuscosmids MPMGc117B0533 4.4.5. Kombination von EST-Projekt und genomischer Sequenzanalyse 5a Zusammenfassung 5b Summary 6. Danksagung 7. Literaturverzeichnis 8. Anhang 8.1 Sequenzvergleich von mermaid-Elementen aus dem Zebrafisch 8.2. Sequenzvergleich repetitiver Elemente des Medaka-Fisches 8.3. Verteilungsschlüssel für die Kartierungsfilter 8.4. Sequenzdaten einiger ´inter-mermaid´-Marker 8.5. Publikationsliste 1 2 4 4 6 9 10 11 13 13 16 23 24 26 26 26 26 26 26 28 29 30 32 32 33 33 33 37 40 43 45 46 49 50 50 50 51 52 52 52 53 54 54 55 56 58 59 62 63 64 64 69 71 71 71 72 77 79 79 80 80 80 81 82 83 84 85 86 86 87 88 89 89 90 91 92 92 94 95 96 97 104 104 106 107 108 125

Ergänzende Angaben:
Online-Adresse:	http://www.diss.fu-berlin.de/2000/38/index.html
Sprache:	Deutsch
Keywords:	Zebrafish, Medakafish, Amphioxus, Genome analysis, genetic mapping, sequence analysis
DNB-Sachgruppe:	32 Biologie
Datum der Disputation:	28-Feb-2000
Entstanden am:	Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie, Freie Universität Berlin
Erster Gutachter:	Professor Hans Lehrach
Zweiter Gutachter:	Professor Ferdinand Hucho
Kontakt (Verfasser):	burgtorf@EMBL-Heidelberg.de
Kontakt (Betreuer):	lehrach@molgen.mpg.de
Besondere Bemerkungen:	Fotos und Grafiken mit Acrobat Exchange 3.01 teilweise nicht oder schlecht zu sehen
Abgabedatum:	22-Mar-2000
Freigabedatum:	24-Aug-2000

 

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