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Digitale Dissertation

Christian Riebeling :
Mechanisms of Regulation of Phospholipase D Isoforms - Involvement in Differentiation and Apoptosis
Regulationsmechanismen von Phospholipase D-Isoformen - Einfluß auf Differenzierung und Apoptose

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|Zusammenfassung| |Inhaltsverzeichnis| |Ergänzende Angaben|

Zusammenfassung

Dissertation Riebeling: Zusammenfassung

4.2 Zusammenfassung

Die Rolle und Funktion der Phospholipase D in Zell-Proliferation, Differenzierung und Apoptose ist bislang nur wenig verstanden. In dieser Arbeit beschreibe ich die Regulation der Phospholipase D in einigen Aspekten dieser zellulärer Prozesse und eine mögliche therapeutische Intervention in einen dieser Signalwege.
Die Rolle der Tyrosinphosphorylierung in der Regulation der Phospholipase D1 wurde mittels eines Protein-Tyrosin-Phosphatase-Inhibitors untersucht. Die induzierte Akkumulation an tyrosinphosphorylierten Proteinen wurde von einer gesteigerten in vitro Phospholipase D-Aktivität begleitet. In Immunpräzipitationsexperimenten konnte gezeigt werden, dass die Phospholipase D1 in HaCaT Keratinozyten im Gegensatz zu HL60 Zellen nicht direkt tyrosinphosphoryliert wird. Beide Effekte konnten durch einen Tyrosin-Kinase-Inhibitor aufgehoben werden. Der Ras/Raf/Mitogen-aktivierte Protein-Kinase-Signalweg ist hierbei nicht beteiligt, wie mit Ras-überexprimierenden HaCaT Keratinozyten gezeigt werden konnte. Phospholipase D1 wird indirekt über Tyrosinphosphorylierung reguliert.
Phospholipase D1 wird in der Ceramid-induzierten Apoptose transkriptionell reguliert. Verschiedene Differenzierungs-assoziierte Gene wie auch Phospholipase D1 werden herunterreguliert während Untereinheiten des Transkriptionsfaktors AP-1 verstärkt exprimiert werden. AP-1 ist an der Expression von differenzierungsassoziierten Genen beteiligt. Die hier präsentierten Daten deuten aber darauf hin, dass die gebildeten Untereinheiten an der Bildung eines Repressors beteiligt sind. Die Expression der Phospholipase D2 verändert sich dagegen nicht.
Im weiteren konnte ich zeigen, dass Zelllinien vom malignen Melanom eine erhöhte Phospholipase D1-Aktivität im Vergleich zu primären Melanozyten besitzen. Während die mRNA-Expression nicht verändert ist, ist die Protein-Menge geringer. Zusätzlich ist die Aktivierbarkeit der Phospholipase D1 mit Phorbolestern in Melanozyten im Gegensatz zu Melanomzellen kaum nachweisbar, obwohl die Expression der Protein-Kinase Ca sich nicht unterscheidet. Möglicherweise fehlt ein inhibitorischer Faktor dieser Interaktion.
Die Reorganisation des Zytoskeletts ist ein wichtiger Prozess in der Metastasierung. Phosphatidsäure und die Phospholipase D1-regulierenden monomeren G-Proteine der Rho-Familie sind an diesem Vorgang beteiligt. Pamidronat wirkt auf Rho-Proteine durch Verringerung seiner Membranassoziation. In dieser Arbeit konnte ich zeigen, dass Pamidronat in Melanomzellen Apoptose auslösen kann. Die Zugabe von Farnesol oder Geranylgeraniol verringert die Pamidronat-induzierte Apoptose, wobei Geranylgeraniol einen stärkeren Inhibitor darstellt. Daraus lässt sich ableiten, dass die verminderte Geranylgeranylierung der wichtigere Schritt in der Pamidronate-induzierten Apoptose ist. Eine der Zelllinien, Mel2A, ist jedoch resistent gegen Pamidronat und zeigt keine verminderte Proliferation und keine Apoptose. Diese Resistenz ist nicht durch ein verändertes Bax/Bcl-2 Ratio verursacht wie mit Bcl-2 überexprimierenden A375 Melanomzellen gezeigt wurde. Die Expression der mRNA von RhoB zeigt keinen starken Unterschied zwischen Melanomzellen und Melanocyten. RhoA und RhoC dagegen sind in Melanomzellen stärker exprimiert, was RhoA und RhoC als mögliche therapeutische Ziele unterstreicht. Während der zytosolische Gehalt an RhoA bei allen vier Melanomzelllinien nach Pamidronat-Behandlung ansteigt, ist in Membranfraktionen die Menge an RhoA nicht verändert. Möglicherweise wirkt eine erhöhte Expression des RhoA-Proteins der verminderten Geranylgeranylierung entgegen. Ob das metastatische Potential durch Pamidronat beeinflusst wird muss im Weiteren noch untersucht werden.

Inhaltsverzeichnis

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Dissertation Riebeling: Contents

Contents

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Title and contents
1. Introduction 1
1.1 Phospholipids in cellular signalling 1
1.2 Mechanisms of regulation of phosphatidylcholine-specific phospholipase D 3
1.3 Biochemistry of phosphatidylcholine-specific phospholipase D 14
1.3.1 Catalysis 14
1.3.2 Structure 16
1.4 Cellular functions of phosphatidylcholine-specific phospholipase D 18
1.4.1 Phosphatidic acid-derived diacylglycerol 19
1.4.2 Protein targets of phosphatidic acid 20
1.4.3 Vesicle transport 20
1.4.4 Stress fibre formation 21
1.5 Scope of this thesis 23
2. Results 24
2.1 Tyrosine phosphorylation of phospholipase D1 24
2.2 Expression of phospholipase D and differentiation-associated genes in ceramide induced apoptosis in HaCaT keratinocytes 27
2.3 Expression of phospholipase D and its stimulatory proteins in melanoma cells and primary cultured melanocytes 30
2.4 Effect of phorbol ester and guanosine-5'-O-(3-thiotriphosphate) on phospholipase D in melanoma cells 32
2.5 Effect of oleate on phospholipase D in melanoma cells 36
2.6 Effect of pamidronate on melanoma cells 37
3. Discussion 46
3.1 Effect of tyrosine phosphorylation on phospholipase D1 46
3.2 Expression of phospholipase D in ceramide-induced apoptosis 48
3.3 Regulation of phospholipase D in melanoma cells and melanocytes 50
3.4 Action of pamidronate on melanoma cells 52
4.1 Summary 55
4.2 Zusammenfassung 57
5. Materials 59
5.1 Reagents 59
5.2 Cell culture materials 60
5.3 Cell lines 60
5.4 Antibodies 61
5.5 Equipment 62
5.6 Primer 64
6. Methods 65
6.1 Cell culture 65
6.1.1 Growth media and solutions 65
6.1.2 Cultivation of cells 66
6.1.3 Freezing and thawing of cells 66
6.2 Lipid chemistry 67
6.2.1 Preparation of substrate vesicles for the in vitro phospholipase D assay 67
6.2.2 Identification and quantification of radioactively labelled lipids 67
6.3 Enzyme reactions 68
6.3.1 Assay of phospholipase D1 activity 68
6.4 Protein chemistry 69
6.4.1 Preparation of cell lysates and subcellular fractionation 69
6.4.2 Determination of protein concentration 69
6.4.3 Discontinuous sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis 70
6.5 Immunochemistry 73
6.5.1 Purification of antibodies 73
6.5.1.1 Preparation of affinity columns 73
6.5.1.2 Affinity chromatography 74
6.5.2 Denaturing immunoprecipitation 75
6.5.3 Western blotting 76
6.5.4 Immunodetection of blotted proteins 77
6.5.5 Immunohistochemical detection using alkaline phosphatase anti alkaline phosphatase antibody (APAAP) complexes 79
6.6 Molecular biology 81
6.6.1 Isolation of total RNA 81
6.6.2 Determination of nucleic acid concentration 82
6.6.3 Synthesis of complementary DNA 82
6.6.4 Polymerase chain reaction 83
6.6.5 Agarose gel electrophoresis 84
6.7 Cell biology 85
6.7.1 Preparation of pervanadate 85
6.7.2 Measurement of proliferation 85
6.7.3 Determination of cytotoxicity 86
6.7.4 Detection of apoptosis 87
7. References 89
8. List of publications 108
8.1 Original publications 108
8.2 Short publications 108
8.3 Manuscripts 109
Curriculum vitae I
Acknowledgements II

Ergänzende Angaben:

Online-Adresse: http://www.diss.fu-berlin.de/2001/100/index.html
Sprache: Englisch
Keywords: phospholipase D, phosphatidylcholine, ADP-ribosylation factor, RhoA, melanoma
DNB-Sachgruppe: 30 Chemie
Datum der Disputation: 25-Jun-2001
Entstanden am: Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie, Freie Universität Berlin
Erster Gutachter: Prof. Dr. Dr. Christoph C. Geilen
Zweiter Gutachter: Prof. Dr. Werner Reutter
Kontakt (Verfasser): c_riebeling@yahoo.com
Kontakt (Betreuer): ccgeilen@zedat.fu-berlin.de
Abgabedatum:20-Jun-2001
Freigabedatum:26-Jun-2001

 

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