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FU Berlin
Digitale Dissertation

Markus Wehland-von Trebra :
Das Rcs-System und die RcsAB-Box
Identifikation eines neuen, essentiellen Operators für die Regulation der enterobakteriellen Kapselbiosynthese
The Rcs-Systems and the RcsAB-Box

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|Zusammenfassung| |Inhaltsverzeichnis| |Ergänzende Angaben|

Zusammenfassung

Die Fähigkeit zur Ausbildung von Kapseln ist unter Bakterien sehr weit verbreitet. Diese Kapseln bestehen aus langkettigen, modular aufgebauten Polysacchariden und stellen die Schnittstelle für die Interaktion des Bakteriums mit seiner Umwelt dar. Bei pathogenen Organismen dient das EPS (Exopolysaccharid) dem Schutz vor Wirts-Abwehrmechnismen und ist gleichzeitig ein zentraler Virulenzfaktor. Die Enterobakterien Escherichia coli, Erwinia amylovora und Pantoea stewartii subsp. stewartii bilden die EPS Colansäure, Amylovoran und Stewartan. Alle diese Kapseln gehören zur Gruppe IA der bakteriellen Polyasccharide. Die Kapsel-Biosynthesegene sind in Operon-artigen Genclustern organisiert (den wza- ams- und cps-Clustern) und werden vom Rcs-System (regulation of capsule synthesis), mit den drei Kernproteinen RcsA, dem durch Phosphorylierung in seiner Aktivität modulierbaren RcsB und RcsC, einem membranständigen Sensorprotein mit Kinaseaktivität, reguliert. Zur Aktivierung der Transkription bindet ein RcsA/RcsB-Heterodimer (RcsAB) an die jeweiligen Promotorsequenzen und initiiert so die mRNA-Synthese. Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, die RcsAB/DNA-Interaktion näher zu charakterisieren. Die apparente Gleichgewichtskonstante KD des RcsAB/ams-Promotor-Komplexes konnte mit Hilfe von Bandshift-Experimenten zu 100 nM, die des RcsAB/wca-Promotors durch Einsatz der Surface Plasmon Resonance (SPR) Technik zu 77 nM bestimmt werden. Durch eine in-vitro-Selektion des ams-Promotors konnte eine erste Konsensussequenz der RcsAB-Bindung formuliert werden (Wehland et al., 1999), die es ermöglichte, durch Datenbankrecherche und EMSA-Bindungsstudien insgesamt 13 RcsAB-Bindungsstellen sowohl in den EPS- und rcsA-Promotoren von E. coli, E. amylovora, P. stewartii, Salmonella typhi und Klebsiella pneumoniae K2, also auch in den bvgA- und fha-Promotoren von Bordetella pertussis und B. parapertussis zu identifizieren. Durch die Zusammenstellung aller Sequenzen war es möglich, ein allgemeines RcsAB-Bindungsmotiv, TaAGaatatTCctA, die in dieser Arbeit so benannte RcsAB-Box zu formulieren (Wehland et al., 2000). Die essentielle Rolle der RcsAB-Box bei der EPS-Regulation konnte durch in-vivo-Experimente bestätigt werden. Neben den RcsAB-Bindungsstellen in den jeweiligen Hauptpromotoren wurden außerdem in den ams- und wca-Operons interne, schwächere Bindungsstellen gefunden, deren biologische Bedeutung aber noch nicht geklärt ist. Die RcsAB-Bindung an rcsA-Promotoren wurde erstmals gezeigt. In-vitro Bindungsassays und in-vivo-Experimente bekräftigten übereinstimmend die zentrale Rolle der RcsAB-Box. Eine Mutation des RcsB-Proteins (RcsB(11D-A)) in seinem Phosphorylierungsmotiv führte zu konstitutiver, RcsA-unabhängiger EPS-Synthese in E. coli. SPR-Analysen ergaben, daß RcsB(11D-A) gegenüber dem Wildtyp-Protein eine zehnfach erhöhte DNA-Affinität besitzt und durch Phosphorylierung nicht deaktiviert werden kann. SPR- und in-vivo-Studien zeigten auch hier, daß die Abwesenheit einer RcsAB-Box die RcsB/DNA-Interaktion komplett beseitigte. Im Rahmen dieser Untersuchungen gelang außerdem mittels SPR-Messungen erstmals der Nachweis einer RcsA/RcsB-Interaktion in Lösung.

Inhaltsverzeichnis

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Titelblatt und Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung 5
Abstract 6
1. Einleitung 7
1.1. Bakterielle Polysaccharide 7
1.2. Funktionen bakterieller Kapseln 8
1.3. Die industrielle Nutzung bakterieller Exopolysaccharide 9
1.4. Typisierung von Kapselpolysacchariden 10
1.5. Die Kapseln von Ew. amylovora, P. stewartii subsp. stewartii und E. coli 12
1.6. Aufgabenstellung 21
2. Materialien 22
2.1. Benutzte Geräte 22
2.2. Bakterienstämme und Plasmide 23
2.3. Medien, Puffer und Lösungen 24
2.4. Primer für die PCR bzw. zur Rekonstitution von Promotorfragmenten 29
3. Methoden 33
3.1. Herstellung elektrokompetenter Bakterienzellen 33
3.2. Herstellung Calcium-kompetenter E. coli Zellen 33
3.3. Transformation elektrokompetenter Bakterienzellen (Elektroporation) 33
3.4. Transformation Calcium-kompetenter Bakterienzellen 34
3.5. Analytische Präparation bakterieller Plasmid-DNA durch alkalische Lyse 34
3.6. Plasmid-DNA-Gewinnung im präparativen Maßstab 35
3.7. DNA-Amplifikation duch die Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) 35
3.8. Sequenzspezifische DNA-Spaltung durch Restriktionsendonukleasen 36
3.9. Ligation von DNA-Fragmenten 37
3.10. Agarose Gelelektrophorese zur Größentrennung von DNA-Fragmenten 37
3.11. DNA Elution aus Agarose-Gelen 38
3.12. Photometrische DNA-Konzentrationsbestimmung 39
3.13. Beta-Galaktosidase-Reportergen-Assay (ONPG-Test) 39
3.14. Digoxigenin-Markierung von Oligonukleotid-Sonden für den Southern-Blot 41
3.15. Southern Blot 41
3.16. Überexpression von Proteinen in E. coli 43
3.17. Zellaufschluß durch Druck in der French Press 45
3.18. Gelperfusionschromatographie 46
3.20. Dialyse 47
3.21. Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford 48
3.22. Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 48
3.23. Färbung von SDS-Polyacrylamid-Gelen mit Coomassie Brilliant Blue 49
3.24. In-vitro-Phosphorylierung von Proteinen 50
3.25. EPS-Präparation 50
3.26. Anthron-Test zur Bestimmung der Glucose-Konzentration 51
3.27. Hybridisierung von Oligonukleotiden 51
3.28. Radioaktive Markierung von Oligonukleotiden mittels Fill-in 51
3.29. Elektrophoretischer Mobilitäts Shift Assay (EMSA) 52
3.30. Szintillationsmessung 53
3.31. In-vitro-Selektion (SELEX) 54
3.32. DNA-Elution aus Polyacrylamidgelen 54
3.33. DNA-Sequenzierung nach Sanger 55
3.34. Biomolekül-Interaktions-Studien mit der Oberflächen Plasmon Resonanz (surface plasmon resonance, SPR) 56
3.35. In-vivo-Mutagenese der bakteriellen chromosomalen DNA durch homologe Rekombination 60
3.36. Isolation bakterieller chromosomaler DNA 63
4. Ergebnisse 64
4.1. Charakterisierung des RcsAB-DNA-Komplexes am Ew. amylovora amsG-Promotor 64
4.2. Bestimmung eines RcsA/RcsB Bindungsmotivs im amsG-Promotor 67
4.3. Identifikation einer RcsA/RcsB-Bindungsstelle im P. stewartii cpsA-Promotor 70
4.4. Lokalisierung einer RcsA/RcsB-Bindungsstelle im E. coli wza-Promotor 73
4.5. RcsA und RcsB binden an die rcsA-Promotoren von E. coli, K. pneumoniae, S. typhi und Ew. amylovora 82
4.6. Identifikation einer RcsAB-Box in den Gen-Clustern für die K2-Antigen-Expression in K. pneumoniae und für die Vi-Anitgen-Expression in S. typhi 88
4.7. Das RcsAB-Heterodimer und BvgA, ein transkriptioneller Regulator aus Bordetella pertussis, erkennen gleiche DNA-Sequenzen. 89
4.8. Identifikation von RcsAB-Bindungsstellen an intergenische Regionen innerhalb des wza-Operons zur Colansäure-Biosynthese von E. coli 91
4.9. Identifikation von RcsAB-Bindungsstellen in intergenischen Regionen innerhalb des ams-Operons zur Amylovoran-Biosynthese von Ew. amylovora 95
4.10. Konstruktion dreier Mutanten-RcsB-Proteine im Phosphorylierungsmotiv 99
5. Diskussion 111
6. Literatur 120
7. Anhang 130
Lebenslauf 130
Veröffentlichungen 131
Danksagung 133

Ergänzende Angaben:

Online-Adresse: http://www.diss.fu-berlin.de/2001/241/index.html
Sprache: Deutsch
Keywords: Rcs-system, capsule biosynthesis, RcsAB-Box, enterobacteria
DNB-Sachgruppe: 30 Chemie
Datum der Disputation: 12-Nov-2001
Entstanden am: Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie, Freie Universität Berlin
Erster Gutachter: Prof. Dr. Wolfram Saenger
Zweiter Gutachter: Prof. Dr. Volker A. Erdmann
Kontakt (Verfasser): markus.wehlandvontrebra@medizin.fu-berlin.de
Kontakt (Betreuer): saenger@chemie.fu-berlin.de
Abgabedatum:29-Nov-2001
Freigabedatum:29-Nov-2001

 

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