FU Berlin Digitale Dissertation
Diana Beyer : Phosphorothiolate als Marker für Interferenzanalysen Phosphorothiolates as a marker for interference analyses
|Zusammenfassung| |Inhaltsverzeichnis| |Ergänzende Angaben|

Zusammenfassung Zusammenfassung Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine neues Modifikationsinterferenzverfahren entwickelt. Die Grundlage dieses Verfahrens bildet die Verwendung von 3?-Phosphorothiolaten als Marker für die zu untersuchende Modifikation. Der Vorteil gegenüber den bisher bestehenden Interferenzverfahren liegt, darin daß der Marker an einer Position sitzt, die nicht aktiv an der Funktion oder der Strukturbildung von RNA-Molekülen beteiligt ist. Darüberhinaus läßt sich die Schwefel-Phosphorbindung selektiv und quantitativ in Gegenwart der nativen Phosphordiesterbindung spalten. Dadurch lassen sich auftretende Interferenzeffekte direkt aus den Bandenmustern quantitativ bestimmen. Die neue Methode wurde mittels chemischer Festphasensynthese dargestellter partiell phosphorothiolat-modifizierter Substratstränge des Hammerhead-Ribozyms etabliert. Die Synthesebedingungen für den vollständigen wie partiellen Einbau von 3?-phosphorothiolat-modifizierten Amiditen und die Quantifizierung der Silberspaltung wurde anhand einer 12 Nukleotide langen Modell-RNA durchgeführt. Die gefundenen Bedingungen wurden dann auf die Synthese des 32-mer Hammerhead-Substratstranges übertragen. Mit der neuen Interferenzmethode wurden die 2?-Hydroxylgruppen der Uridine im konservierten Bereich des Hammerheads untersucht. Für die Position U16.1 konnte kein Interferenzeffekt, für die Position U7 ein leichter und für Position U4 ein starker Interferenzeffekt beobachtet werden. Die Zuverlässigkeit dieser Ergebnisse konnte durch Experimente mit singulär desoxymodifizierten Substratstränge bestätigt werden. Die kinetischen Konstanten wurden unter single turnover Bedingungen ermittelt. In Kontrollexperimenten, bei denen der Substratstrang nur die 3?-Phosphorothiolat Modifikation trug, konnte kein Einfluß der Schwefel-Phosphor-Bindung auf die Hammerhead-Spaltung festgestellt werden. Die hier vorgestellte neue Interferenzmethode läßt sich allgemein auf funktionelle Nukleinsäuren anwenden. Es dient zum einen der Identifikation von essentiellen funktionellen Gruppen und somit der Identifikation von z.B. aktiven Zentren von Ribozymen oder bindenden Regionen von Aptameren und zum anderen können funktionelle Nukleinsäuren gezielt gegen Nukleasen resistent gemacht werden.

Inhaltsverzeichnis Die gesamte Dissertation können Sie als gezippten tar-File oder als zip-File laden. Durch Anklicken der Kapitelüberschriften können Sie das Kapitel in PDF-Format laden: Inhaltsverzeichnis Titelblatt Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 1 1.1 Die RNA-Welt 1 1.2 Ribozyme 2 1.3 Metallionen und Ribozyme 3 1.4 Hammerhead-Ribozym 5 1.5 Hammerhead-Ribozym Kinetik 10 1.6 Modifizierte RNA 12 1.7 Modifikationsinterferenzanalysen 17 2 Aufgabenstellung 21 3 Methoden 23 3.1 Organische Synthesen 23 3.2 Chemische Synthese von Nukleinsäuren 30 3.3 Methoden zur Konzentrationsbestimmung von RNA 32 3.4 Methoden zur Reinigung von Nukleinsäuren 34 3.5 Methoden zum Nachweis von Nukleinsäuren 37 3.6 Methoden zur Markierung von Nukleinsäuren 38 3.7 Kinetik der Hammerhead-Spaltung 40 3.8 Phosphorothiolat-Interferenzstudien 41 4 Ergebnisse 43 4.1 Synthese der thiomodifizierten Amidite 44 4.2 Optimierung des Synthesezyklus 47 4.3 Interferenzanalysen 55 4.4 Singuläre Desoxyuridin-Modifikationen 64 5 Diskussion 67 Etablierung des neuen Interferenzverfahrens 67 Interferenzanalyse des Hammerhead-Ribozyms 70 Ausblick 74 6 Zusammenfassung 75 7 Summary 77 8 Literaturverzeichnis 79 Anhang 85

Ergänzende Angaben:
Online-Adresse:	http://www.diss.fu-berlin.de/2001/7/index.html
Sprache:	Deutsch
Keywords:	phosphorothiolate, hammerhead ribozyme, interference analyses
DNB-Sachgruppe:	30 Chemie
Datum der Disputation:	20-Dec-2000
Entstanden am:	Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie, Freie Universität Berlin
Erster Gutachter:	Prof. Volker A. Erdmann
Zweiter Gutachter:	Prof. Wolfram Saenger
Kontakt (Verfasser):	diana@chemie.fu-berlin.de
Kontakt (Betreuer):	fuerste@chemie.fu-berlin.de
Abgabedatum:	22-Jan-2001
Freigabedatum:	30-Jan-2001

 

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