Zusammenfassung
In dieser Arbeit wurde redoxaktive
Kofaktoren, die an Elektronentransferprozesse (ET) in Proteinen beteiligt
sind durch Berechnung der elektrostatischen Energien untersucht. Das Hauptaugenmerk
war dabei auf die Berechnung der Energien der Protonierungs- und Oxidationsreaktionen
in Redoxproteinen gerichtet. Die Kopplungen zwischen Protonierungs- und
Elektronentransferreaktionen und die pH Abhängigkeit von Redoxpotentialen
in Proteinen (der sogenannte Bohr Effekt) wurden mit Methoden der elektrostatischer
Kontinuum untersucht. Häm-Proteine, in denen die Histidine axial an
das Häm-Eisen koordinieren, wie zum Beispiel das mitochondriale Cytochrom
bc1 (Cbc1),
das in der Atmungskette am Elektronentransport beteiligt ist, und das künstliche
Cytochrom b (Cb) wurden untersucht. Das Protonierungs- und Redoxverhalten
von Flavin, Tryptophanen und Tyrosin in DNA Photolyase wurde ebenfalls
untersucht. Die hier präsentierte Ergebnisse der theoretischen Untersuchungen
wurden in drei Abschnitten beschreiben.
Die Faktoren, die die Orientierung
der Häm axial an koordinierten Imidazole beeinflussen, wurden durch
die Analyse von 693 Häm aus 432 Kristallstrukturen von Häm-Proteinen
aus der Protein Data Bank (PDB) bestimmt. Die Ergebnisse der Datenbanksuche
wurden mit Hilfe von molekularen Kraftfeld Simulationen interpretiert,
wobei die relevanten Interaktionen verglichen wurden.
Im zweiten Teil wurden die Atomkoordinaten
eines künstlichen Proteins generiert, wobei eine sehr aufwendige Modelling
Technik mit schrittweiser Energierelaxierung eingesetzt wurde. Dieser neue
Ansatz wurde auf ein de novo synthetisches Protein angewendet, das von
Rau & Hähnel (1998) synthetisiert wurde, und welches den zentralen
Teil des four-helix bundle des nativen Cytochrom b's nachbildet. Die Stabilität
der computergenerierten Strukturen wurde getestet, in dem bei Langzeit-Dynamiksimulationen
die Konformationsänderungen und Fluktuationen mit den Ergebnissen
der gleichen Simulationen der Kristallstruktur des nativen Cb verglichen
wurden. Die Ergebnisse der MD Simulationen zeigen, daß die computergenerierte
Struktur stabil und relaxiert ist.
Die Protonierungs- und Oxidationswahrscheinlichkeiten
titrierbarer Gruppen wurden gleichzeitig mit Hilfe der Kontinuumselektrostatik
Methode berechnet, bei der die linearisierte Poisson-Boltzmann Gleichung
(LPBE) numerisch auf einem Gitter gelöst wird und anschließend
eine Monte Carlo Titration aller titrierbaren Gruppen im Protein durchgeführt
wird. Die quantenchemischen Rechnungen wurden für jedes bis-Imidazol-Häm
System ausgeführt und lieferten die atomaren Partialladungen, die
die elektrostatischen Potentiale der redox-aktiven Gruppen in der Nachbarschaft
wiedergeben. Die angewendeten theoretische Methoden erlaubten es, die Protonierungs-
und Oxidationsmuster des Proteins als eine Funktion des pHs und des Redoxpotentials
der Lösung zu berechnen. Die bestehenden Methoden wurden erweitert,
um Redoxtitrationen eines Proteins auszuführen, bei denen das Lösungspotential
variiert wurde und der pH konstant gehalten wurde. Auf diese Art und Weise
konnten wertvolle Einblicke in die Funktionsweisen von Redoxzentren in
Proteinen gewonnen werden.
Im tritten Teil wurde der Ansatz
der Kontinuumselektrostatik auf das künstliche und native Cb angewendet,
um das Titrationsverhalten der ionisierbaren Residuen zu untersuchen, das
Redoxpotential der Häm zu berechnen und die mit dem Bohr Effekt zusammenhängenden
Phänomene zu untersuchen. Der Einfluss von unterschiedlichen strukturellen
Faktoren auf das Redoxpotential der zwei Häm Gruppen im künstlichen
Cb wurde untersucht. Dies ermöglichte es zu verstehen, wie die Proteinumgebung
das Redoxpotential von Kofaktoren anpasst. Um die Energetik der Photoreaktivierung
und die Redoxpotentiale der unterschiedlichen Redoxpaare (Tryptophane,
Tyrosine, FAD) zu untersuchen, die an dem Elektronen- und Protonentransfer
in DNA Photolyase aus E. coli beteiligt sind, wurde der gleiche
Ansatz wie beim Cytochrom b angewendet. Eine empirische Gleichung (basierend
auf der Marcus Theorie) wurde verwendet, um die Raten der ET Reaktion abzuschätzen.
Gute Übereinstimmung zwischen
den berechneten und dem experimentell ermittelten Titrationsverhalten und
den Reaktionsraten deutet an, daß die angewendete theoretische Methode
geeignet ist und das elektrostatische Verhalten in solchen Systemen widerspiegelt,
obwohl Änderungen der Konformation und Unterschiede in den gemittelten
Strukturen, die zwischen Kristall und Lösung bestehen mögen.
Es zeigt auch an, daß die elektrostatischen Wechselwirkungen für
Proteine die wohl wichtigste Rolle spielen, während nicht-elektrostatische
Wechselwirkungen, die theoretisch weit schwieriger zugänglich sind,
offenbar weniger wichtig sind.
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