Zusammenfassung
Die Applikation von [Arg8]-Vasopressin (AVP) löste
in A7r5-Zellen einen Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration aus,
der aus einer Ca2+-Freisetzungs- und einer Ca2+-Einstromkomponente
bestand. In Patch-Clamp-Experimenten führte die Applikation von AVP in
A7r5-Zellen zur Aktivierung eines nichtselektiven Kationenstroms.
Dieser Kationenstrom zeigte eine charakteristische, doppelt rektifizierende
Strom-Spannungs-Beziehung, die den für einige rekombinant-exprimierte
TRPC-Kanäle beschriebenen Kennlinien auffallend ähnelte.
Der AVP-induzierte Kationenstrom wurde durch Lanthan (La3+)
und Gadolinium (Gd3+) blockiert. Die Effekte von extrazellulärem
Ca2+ auf den Kationenstrom waren komplex und umfassten sowohl
stimulierende als auch inhibierende Anteile. Die direkte Aktivierung von G-Proteinen
durch Infusion von Aluminiumfluorid aktivierte einen Kationenstrom, der die gleichen
Eigenschaften besaß wie der AVP-induzierte Strom. Desweiteren führte
auch die Stimulation von Rezeptoren (z.B. durch PDGF = platelet-derived
growth factor), die an an PLCg
koppeln, zur Aktivierung des beschriebenen Kationenstroms.
Sowohl die Entleerung intrazellulärer Speicher als auch die Erhöhung
der cytosolischen Ca2+-Konzentration konnten als Aktivierungsmechanismus
ausgeschlossen werden.
Dagegen aktivierte 1-Oleoyl-2-acetyl-sn-Glycerol (OAG), ein
membranpermeables DAG-Analog, den Kationenstrom.
Diese Aktivierung war unabhängig von Proteinkinasen C (PKC).
Die PKC-unabhängige Aktivierung durch DAG-Analoga ist eine
charakteristische Eigenschaft der Kanäle der TRPC3/6/7-Gruppe.
Ebenso wie die Ströme durch den heterolog exprimierten TRPC6-Kanal
wurde der endogene Kationenstrom in A7r5-Zellen durch Applikation von
Flufenamat vergrößert. Northern-Blot-Hybridisierungs-analysen zeigten,
dass A7r5-Zellen lediglich mRNA für TRPC1 und TRPC6 exprimieren.
Die Übereinstimmung von elektrophysiologischen und
molekular-biologischen Befunden legt nahe, dass TRPC6 eine wichtige
Komponente des AVP-aktivierten Kationenkanals in A7r5-Zellen ist.
Um zu untersuchen, ob TRPC6 generell in der glatten Gefäßmuskulatur
von Bedeutung ist, wurden zwei weitere Präparationen von glatten
Gefäßmuskel-zellen betrachtet. In glatten Muskelzellen der Vena cava
der Ratte, löste AVP ebenfalls einen Ca2+-Einstrom aus.
Allerdings konnte in diesen Zellen weder ein agonistinduzierter Kationenstrom
noch mRNA für TRPC2 - 6 nachgewiesen werden.
Vorläufige Untersuchungen an primärkultivierten glatten Muskelzellen
der Aorta neonataler und adulter Ratten zeigten dagegen die Aktivierung eines
Kationenstroms, der dem in A7r5-Zellen beobachteten Strom sehr ähnlich war.
Um die Eigenschaften der nativen Ströme in A7r5-Zellen mit denen von
heterolog exprimiertem TRPC6 zu vergleichen, wurde das Rattenortholog von
TRPC6 (rTRPC6) kloniert und nach rekombinanter Expression elektrophysiologisch
charakterisiert. Außerdem wurde das Verhalten
von rTRPC6 mit dem von mTRPC5 (aus Maus) verglichen. TRPC5 gehört zu der
TRPC4/5-Untergruppe, die sich strukturell und funktionell von der
TRPC3/6/7-Untergruppe unterscheidet.
Extrazelluläres Ca2+ hatte eine hemmende Wirkung
auf rTRPC6, während die Stromamplitude im Falle von mTRPC5
durch Erhöhung der extrazellulären Ca2+-Konzentration
vergrößert wurde. Für rTRPC6
konnte eine Hemmung durch La3+ und Gd3+ gezeigt
werden. mTRPC5-Kanäle wurden durch millimolare Konzentrationen von
La3+ und Gd3+ ebenfalls blockiert, mikromolare
Konzentrationen wirkten dagegen potenzierend. Der duale Effekt von
La3+ auf mTRPC5 war auch auf der Einzelkanalebene zu beobachten.
Die Einzelkanalleitfähigkeit nahm mit ansteigender
La3+-Konzentration ab, die Öffnungswahrscheinlichkeit
hingegen nahm zu. TRPC5- und
TRPC6-Kanäle werden also durch extrazelluläres Ca2+
sowie durch La3+ und Gd3+ unterschiedlich reguliert.
Diese Eigenschaften sind deshalb ein wichtiges Hilfsmittel, um die Beteiligung
von Kanälen der TRPC3/6/7- bzw. der TRPC4/5-Gruppe an
Rezeptor-vermittelten Kationenleitfähigkeiten in nativen Zellen
nachzuweisen und zwischen beiden Kanalgruppen zu unterscheiden.
Der wichtigste Befund der vorliegenden Arbeit ist, dass TRPC6 eine
molekulare Komponente des Rezeptor-stimulierten Kationenkanals in
A7r5-Zellen darstellt. Insbesondere zeigt die vorliegende Studie eine klare
Übereinstimmung zwischen endogenen Rezeptor-stimulierten
Kationenströmen und solchen, die nach rekombinanter Überexpression
einzelner TRPC-Isoformen beobachtet werden.
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