Zusammenfassung
Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD+) ist ein bedeutendes Molekül als Coenzym bei zellulären Redox-Reaktionen und Signaltransduktionswegen. An seiner Biosynthese ist das Enzym Nicotinamid/Nicotinat-Mononukleotid-Adenylyltransferase (NMNAT/NaMNAT) beteiligt, indem es den Adenosin-Monophosphat-Teil von ATP auf Nicotinamid- oder Nicotinat-Mononukleotid (NMN/NaMN) überträgt.
Die Kristallstruktur von NMNAT von Homo sapiens im Komplex mit NMN wurde mit einer maximalen Auflösung von 2.9 Å durch die SAD-Methode gelöst. Die Struktur von NMNAT besteht aus einem sechssträngigen parallelen b-Faltblatt mit Helices auf beiden Seiten, welches im Kern dem Rossmann-Faltungstyp entspricht. Elektronendichte wird weiterhin für den Liganden NMN beobachtet, nicht jedoch für eine Schleife von 37 Aminosäuren, Reste 109 bis 146, die strukturell ungeordnet sind. Von den homologen Proteinen aus M. thermoautotrophicum und M. jannaschii unterscheidet es sich durch diese Schleife, die eine nukleäre Lokalisationssequenz NLS enthält, und durch zusätzliche Aminosäuren, die im humanen Enzym die Helices H und I sowie den Strang f bilden. Diese Sekundärstrukturelemente verursachen ein unterschiedliches Oligomerisierungsverhalten als in den Proteinen aus Archaea, die jedoch alle als biologische Einheit ein Hexamer bilden. Bakterielle NMNAT kommt dagegen als Monomer (E. coli) oder Dimer (B. subtilis) vor und weist im Fall von E. coli NMNAT noch weitere zusätzliche Sekundärstrukturelemente auf.
An der Bindung des Liganden NMN sind die Aminosäuren Ser16, Lys57, Trp92, Thr95, Leu168 und Trp169 beteiligt, die sich alle auf einer Seite des b-Faltblattes befinden. Durch einen Vergleich mit weiteren, von anderen Gruppen publizierten Strukturen der humanen NMNAT (dem Apoenzym und dem NAD+-Komplex) sowie mit den Archaea- und Prokaria-Analoga wurde ein Modell für die Ligandenbindung und Synthesereaktion entwickelt.
Die Homing Endunuklease PI-SceI von S. cerevisiae ist ein Intein, eine interne Proteinsequenz, eingebettet in die Extein-Sequenzen der 69 kDa-Untereinheit der vakuolären Membran-H+-ATPase. In einem Protein-Splicing-Prozess schneidet sie sich selbst aus dem Vorläuferprotein heraus. Verantwortlich hierfür ist die Domäne I von PI-SceI, die gleichzeitig den Hauptteil der Bindungsenergie für eine spezifische DNA-Sequenz von mindestens 31 bp liefert. Die Domäne II von PI-SceI besitzt das endonukleolytische Zentrum, welches die spezifische Erkennungssequenz schneidet und die Insertion des vde-Gens initiiert ("homing").
Die Kristallstruktur der Domäne I von PI-SceI wurde mit der Methode des Molekularen Ersatzes bei einer maximalen Auflösung von 1.35 Å gelöst. Der Kernbereich der PI-SceI Domäne I nimmt den Hint-Faltungstyp der Hedgehog/Intein-Domäne ein und besteht hauptsächlich aus b-Strängen. Das aktive Zentrum der Domäne I, die Protein-Splicing-Stelle, zeigt neben Cystein1 noch zwei N-terminale Extein-Reste, ihm fehlt jedoch mit Asn454 der Intein-C-Terminus. Das gängige Modell für den ersten Schritt des Protein-Splicing-Reaktionsmechanismus' kann strukturell bestätigt werden.
Die Reste Gln55 bis Glu66 wurden aufgrund lokaler Unordnung nicht in der Elektronendichte beobachtet. Sie bilden offenbar eine flexible Schleife, die im Verdacht steht, an der festen DNA-Bindung der Domäne I beteiligt zu sein. Die weiteren Reste, denen aufgrund biochemischer Daten eine Beteiligung an der Bindung zugerechnet wird, befinden sich alle an der Vorderseite der zangenartigen Subdomäne, die von den Strängen i, j und k sowie von den Helices B und C gebildet wird. Wahrscheinlich können auch die Helices D und E sowie der Strang l dazugezählt werden, wo ebenfalls potenziell DNA bindende Aminosäuren liegen.
Für diese Subdomäne wird aufgrund eines geometriebasierten Docking-Modells eine Flip-Bewegung für möglich gehalten, die etwa 60º relativ zum Kernbereich der Domäne I beträgt.
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