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FU Berlin
Digitale Dissertation

Erik Werner :
Zwei Wege, Nukleotide zu binden
Kristallstrukturen der Nicotinamid-Mononukleotid-Adenylyltransferase von Homo sapiens und der Domäne I der Homing Endonuklease PI-SceI von Saccharomyces cerevisiae
Two Ways of Binding Nucleotides

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|Zusammenfassung| |Inhaltsverzeichnis| |Ergänzende Angaben|

Zusammenfassung

Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD+) ist ein bedeutendes Molekül als Coenzym bei zellulären Redox-Reaktionen und Signaltransduktionswegen. An seiner Biosynthese ist das Enzym Nicotinamid/Nicotinat-Mononukleotid-Adenylyltransferase (NMNAT/NaMNAT) beteiligt, indem es den Adenosin-Monophosphat-Teil von ATP auf Nicotinamid- oder Nicotinat-Mononukleotid (NMN/NaMN) überträgt.
Die Kristallstruktur von NMNAT von Homo sapiens im Komplex mit NMN wurde mit einer maximalen Auflösung von 2.9 Å durch die SAD-Methode gelöst. Die Struktur von NMNAT besteht aus einem sechssträngigen parallelen b-Faltblatt mit Helices auf beiden Seiten, welches im Kern dem Rossmann-Faltungstyp entspricht. Elektronendichte wird weiterhin für den Liganden NMN beobachtet, nicht jedoch für eine Schleife von 37 Aminosäuren, Reste 109 bis 146, die strukturell ungeordnet sind. Von den homologen Proteinen aus M. thermoautotrophicum und M. jannaschii unterscheidet es sich durch diese Schleife, die eine nukleäre Lokalisationssequenz NLS enthält, und durch zusätzliche Aminosäuren, die im humanen Enzym die Helices H und I sowie den Strang f bilden. Diese Sekundärstrukturelemente verursachen ein unterschiedliches Oligomerisierungsverhalten als in den Proteinen aus Archaea, die jedoch alle als biologische Einheit ein Hexamer bilden. Bakterielle NMNAT kommt dagegen als Monomer (E. coli) oder Dimer (B. subtilis) vor und weist im Fall von E. coli NMNAT noch weitere zusätzliche Sekundärstrukturelemente auf.
An der Bindung des Liganden NMN sind die Aminosäuren Ser16, Lys57, Trp92, Thr95, Leu168 und Trp169 beteiligt, die sich alle auf einer Seite des b-Faltblattes befinden. Durch einen Vergleich mit weiteren, von anderen Gruppen publizierten Strukturen der humanen NMNAT (dem Apoenzym und dem NAD+-Komplex) sowie mit den Archaea- und Prokaria-Analoga wurde ein Modell für die Ligandenbindung und Synthesereaktion entwickelt.

Die Homing Endunuklease PI-SceI von S. cerevisiae ist ein Intein, eine interne Proteinsequenz, eingebettet in die Extein-Sequenzen der 69 kDa-Untereinheit der vakuolären Membran-H+-ATPase. In einem Protein-Splicing-Prozess schneidet sie sich selbst aus dem Vorläuferprotein heraus. Verantwortlich hierfür ist die Domäne I von PI-SceI, die gleichzeitig den Hauptteil der Bindungsenergie für eine spezifische DNA-Sequenz von mindestens 31 bp liefert. Die Domäne II von PI-SceI besitzt das endonukleolytische Zentrum, welches die spezifische Erkennungssequenz schneidet und die Insertion des vde-Gens initiiert ("homing").
Die Kristallstruktur der Domäne I von PI-SceI wurde mit der Methode des Molekularen Ersatzes bei einer maximalen Auflösung von 1.35 Å gelöst. Der Kernbereich der PI-SceI Domäne I nimmt den Hint-Faltungstyp der Hedgehog/Intein-Domäne ein und besteht hauptsächlich aus b-Strängen. Das aktive Zentrum der Domäne I, die Protein-Splicing-Stelle, zeigt neben Cystein1 noch zwei N-terminale Extein-Reste, ihm fehlt jedoch mit Asn454 der Intein-C-Terminus. Das gängige Modell für den ersten Schritt des Protein-Splicing-Reaktionsmechanismus' kann strukturell bestätigt werden.
Die Reste Gln55 bis Glu66 wurden aufgrund lokaler Unordnung nicht in der Elektronendichte beobachtet. Sie bilden offenbar eine flexible Schleife, die im Verdacht steht, an der festen DNA-Bindung der Domäne I beteiligt zu sein. Die weiteren Reste, denen aufgrund biochemischer Daten eine Beteiligung an der Bindung zugerechnet wird, befinden sich alle an der Vorderseite der zangenartigen Subdomäne, die von den Strängen i, j und k sowie von den Helices B und C gebildet wird. Wahrscheinlich können auch die Helices D und E sowie der Strang l dazugezählt werden, wo ebenfalls potenziell DNA bindende Aminosäuren liegen.
Für diese Subdomäne wird aufgrund eines geometriebasierten Docking-Modells eine Flip-Bewegung für möglich gehalten, die etwa 60º relativ zum Kernbereich der Domäne I beträgt.


Inhaltsverzeichnis

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TITEL, INHALT, ABKÜRZUNGEN
TITEL

1. INHALTSVERZEICHNIS 6

2. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 8

3. EINLEITUNG 11
     3.1. NUKLEOTIDE 11
     3.2. NUKLEINSÄUREN 12
     3.3. KRISTALLOGRAPHIE ALS METHODE DER STRUKTURBESTIMMUNG 14

4. DIE NICOTINAMID-MONONUKLEOTID-ADENYLYLTRANSFERASE VON HOMO SAPIENS 17
     4.1. EINLEITUNG 17
           4.1.1. Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid NAD+ 17
           4.1.2. Nicotinamid-Mononukleotid-Adenylyltransferase NMNAT 18
           4.1.3. Strukturen von NMNATs 20
     4.2. MATERIAL UND METHODEN 22
           4.2.1. Expressionsklonierung und Proteinreinigung 22
           4.2.2. Aktivitätstest und Massenspektrum 22
           4.2.3. Kristallisation und Kryoprotektion 23
           4.2.4. Röntgendiffraktion, Phasenbestimmung und Verfeinerung 24
     4.3. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 24
           4.3.1. Genexpression, Proteinqualität und -aktivität 24
           4.3.2. Nachweis von Selen 26
           4.3.3. Kristallisation und Kryoprotektion 28
           4.3.4. Diffraktion 29
           4.3.5. Phasenbestimmung und Verfeinerung 30
           4.3.6. Anzahl der Monomere pro asymmetrischer Einheit 34
           4.3.7. Struktur von hNMNAT 38
           4.3.8. Vergleich mit anderen Strukturen von humaner NMNAT 39
           4.3.9. Vergleich mit Strukturen von NMNAT anderer Spezies 45
           4.3.10. Superfamilie, Rossmann-Faltungstyp 49
           4.3.11. Oligomerisierung, Protein-Protein-Kontakte 51
           4.3.12. Ligandenbindung in humaner NMNAT 55

5. DIE HOMING ENDONUKLEASE PI-SCEI VON SACCHAROMYCES CEREVISIAE 65
     5.1. EINLEITUNG 65
           5.1.1. Inteine und Homing Endonukleasen 65
           5.1.2. Die Homing Endonuklease PI-SceI 66
           5.1.3. PI-SceI Domäne II: Endonuklease-Aktivität 67
           5.1.4. PI-SceI Domäne I: Protein-Splicing-Aktivität 69
           5.1.5. DNA-Bindung 70
           5.1.6. Warum Struktur Nummer Fünf? 73
     5.2. MATERIAL UND METHODEN 76
           5.2.1. Genexpression und Proteinreinigung 76
           5.2.2. DNA-Bindung 77
           5.2.3. Kristallisation 78
           5.2.4. Röntgendiffraktion, Datenreduktion und Strukturbestimmung 78
     5.3. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 79
           5.3.1. Expression, Proteinreinigung und Kristallisation 79
           5.3.2. DNA-Bindungsversuche 81
           5.3.3. Diffraktion und Strukturbestimmung 83
           5.3.4. Struktur der Domäne I von S. cerevisiae PI-SceI 87
           5.3.5. Vergleich aller Strukturen von PI-SceI Domäne I 89
           5.3.6. Protein-Splicing-Stelle 96
           5.3.7. DNA-Bindung 99
           5.3.8. Geometriebasiertes Docking 103

6. ZUSAMMENFASSUNG - SUMMARY 109
     6.1. DEUTSCH - GERMAN 109
           6.1.1. Nicotinamid-Mononukleotid-Adenylyltransferase von Homo sapiens im Komplex mit Nicotinamid-Mononukleotid 109
           6.1.2. Domäne I der Homing Endonuclease PI-SceI von Saccharomyces cerevisiae 111
     6.2. ENGLISCH - ENGLISH 113
           6.2.1. Nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase of Homo sapiens in complex with nicotinamide mononucleotide 113
           6.2.2. Domain I of the homing endonuclease PI-SceI of Saccaromyces cerevisiae 115

7. VERÖFFENTLICHUNGEN 117

8. ABBILDUNGSVERZEICHNIS 118

9. TABELLENVERZEICHNIS 121

10. LITERATURVERZEICHNIS 123

11. DANKSAGUNG 131

12. CURRICULUM VITAE 133

13. EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG 135


Ergänzende Angaben:

Online-Adresse: http://www.diss.fu-berlin.de/2002/179/index.html
Sprache: Deutsch
Keywords: protein crystallography, nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase, homing endonuclease
DNB-Sachgruppe: 30 Chemie
Datum der Disputation: 19-Aug-2002
Entstanden am: Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie, Freie Universität Berlin
Erster Gutachter: Prof. Dr. Udo Heinemann
Zweiter Gutachter: PD Dr. Mathias Ziegler
Kontakt (Verfasser): ewe@iscience.de
Kontakt (Betreuer): heinemann@mdc-berlin.de
Besondere Bemerkungen: Die komplette Zusammenfassung, die Abbildungen in höherer Qualität und das mit PubMed verlinkte Literaturverzeichnis unter http://www.ewerner.de/diss/.The complete abstract, the pictures in higher quality and the PubMed-linked references at http://www.ewerner.de/diss/.
Abgabedatum:05-Sep-2002
Freigabedatum:10-Sep-2002

 


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