FU Berlin Digitale Dissertation
Felix Bermpohl : Nachweis und Charakterisierung der Endopeptidase-Aktivität der Dipeptidylpeptidase IV (DPP IV) Demonstration and characterization of the endopeptidase activity of dipeptidyl peptidase IV (DPP IV)
|Zusammenfassung| |Inhaltsverzeichnis| |Ergänzende Angaben|

Zusammenfassung Die Dipeptidylpeptidase IV (DPP IV, CD 26) ist ein dimeres Typ II-Membranprotein, das in zahlreichen Geweben und Zellen von Säugetieren vorkommt. Innerhalb des Clans SC der nicht-klassischen Serinpeptidasen wird die DPP IV der Prolyl-Oligopeptidase-Familie (S9) zugerechnet. Sie weist eine gut charakterisierte Exopeptidase-Aktivität mit bevorzugter Spaltung hinter Prolin und Alanin auf. Ob die DPP IV darüber hinaus auch eine Endopeptidase-Aktivität besitzt, sollte in der vorliegenden Arbeit untersucht werden. Zunächst wurde aktive DPP IV in einem dreistufigen Reinigungsverfahren, das als letzten Schritt eine Immunaffinitätschromatographie enthielt, isoliert. Das gereinigte Enzym wurde sowohl in einem Zymographie-Assay als auch in einem löslichen proteolytischen Assay zum Nachweis der spezifischen Endopeptidase-Aktivität der DPP IV eingesetzt. Dabei konnten die denaturierten fibrillären Kollagene der Typen I, II, III und V als Substrate der DPP IV-Endopeptidase-Aktivität identifiziert werden. Pro min wurden durch 1 mg der eingesetzten DPP IV-Präparation ungefähr 7,0 x 10-6 µmol der Typ I-Kollagen-Alpha-Ketten abgebaut, womit die Spaltungsrate als relativ niedrig zu bewerten ist. Denaturiertes Basalmembran-Kollagen (Typ IV) wurde deutlich langsamer hydrolysiert, während natives Kollagen, Albumin, Fibronektin und DPP IV selbst nicht verdaut wurden. Die höchste DPP IV-Endopeptidase-Aktivität wurde im physiologischen pH-Bereich bei 37°C beobachtet. Spaltprodukte wurden im Immunblot als relativ zahlreiche und diffuse Zwischenbanden sichtbar, so dass die DPP IV offenbar die Ketten des denaturierten Kollagens an zahlreichen Stellen spaltet. Bei Einsatz verschiedener Peptidase-Inhibitoren im löslichen proteolytischen Assay ergab sich für die Exo- und die Endopeptidase-Aktivität der DPP IV ein weitgehend übereinstimmendes Inhibitionsprofil, was auf ein gemeinsames katalytisches Zentrum schließen lässt. In immunhistochemischen Untersuchungen mit Anti-Kollagen I-Antikörpern wurden bei DPP IV-negativen Fischer 344-Ratten im Disse'schen Raum der Leber vermehrt faserartige Strukturen nachgewiesen, bei denen es sich wahrscheinlich um retikuläre Fasern handelt, deren Abbau offenbar infolge der fehlenden DPP IV-Expression gestört ist. Als mögliche biologische Funktionen der hier erstmals gezeigten DPP IV-Endopeptidase-Aktivität kommen eine Beteiligung am Kollagenkatabolismus, an Zelladhäsionsprozessen, an der Translokation von Zellen sowie an der Resorption von prolinhaltigen Peptiden in Frage.

Inhaltsverzeichnis Die gesamte Dissertation können Sie als gezippten tar-File oder als zip-File laden. Durch Anklicken der Kapitelüberschriften können Sie das Kapitel in PDF-Format laden: 0 Titelblatt und Inhalt 1 Einleitung und Zielsetzung 1.1 Die proteolytischen Enzyme 1.2 Aufbau, Vorkommen und Funktion der DPP IV 1.2.1 Die Struktur der DPP IV 1.2.2 Die Gewebeverteilung der DPP IV 1.2.3 Die Exopeptidase-Aktivität der DPP IV 1.2.4 Die Endopeptidase-Aktivität der DPP IV 1.3 Die Großfamilie der Kollagene 1.3.1 Das Bauprinzip der Kollagene 1.3.2 Die Kollagentypen 1.3.3 Der Kollagenkatabolismus 1.4 Zielsetzung 2 Versuchstiere, Material und Methoden 2.1 Versuchstiere 2.2 Material 2.2.1 Geräte 2.2.2 Chemikalien und Verbrauchswaren 2.2.3 Antikörper 2.2.4 Puffer 2.3 Methoden 2.3.1 Proteinchemische Methoden 2.3.1.1 Allgemeine proteinbiochemische Verfahren 2.3.1.1.1 Proteinbestimmung 2.3.1.1.2 Bestimmung der DPP IV-Exopeptidase-Aktivität 2.3.1.2 Verfahren zur Isolierung von Membranfraktionen 2.3.1.2.1 Gewinnung von Rohmembranen aus Nierenrinden 2.3.1.2.2 Solubilisierung von Membranproteinen 2.3.1.3 Chromatographische Verfahren 2.3.1.3.1 Dünnschichtchromatographie 2.3.1.3.2 Affinitätschromatographie an Concanavalin A-Sepharose 2.3.1.3.3 Immunaffinitätschromatographie an mAk 13.4-Sepharose 2.3.1.3.3.1 Kopplung des mAk 13.4 an Protein G-Sepharose 2.3.1.3.3.2 Immunaffinitätschromatographie an mAk 13.4-Sepharose 2.3.1.4 Elektrophoretische Verfahren 2.3.1.4.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 2.3.1.4.2 Western-Blotting 2.3.1.5 Färbungen von PAGE-Gelen 2.3.1.5.1 Coomassie-Blue G-250 2.3.1.5.2 Silberfärbung 2.3.1.6 Nachweisverfahren auf Blot-Matrices 2.3.1.6.1 Ponceau-Rot 2.3.1.6.2 Substratfärbung zum Nachweis aktiver DPP IV 2.3.1.6.3 Immunblot 2.3.1.7 Enzymatische Verdauungen 2.3.1.7.1 Gelatin-Zymographie 2.3.1.7.2 Löslicher proteolytischer Assay 2.3.2 Histochemische Methoden 2.3.2.1 Kryostatschnittherstellung 2.3.2.2 DPP IV-Aktivitätshistochemie 2.3.2.3 Kollagen-Immunhistochemie mit polyklonalen Primärantikörpern 3 Ergebnisse 3.1 Reinigung und Charakterisierung von DPP IV aus der Nierenrinde 3.1.1 Reinigung von aktiver DPP IV 3.1.2 Darstellung von DPP IV-Formen in der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese 3.1.3 N-terminale Sequenzierung des 60 kD-Proteins 3.2 Etablierung zweier Assays zur Untersuchung gelatinolytisch aktiver Peptidasen 3.2.1 Gelatin-Zymographie 3.2.1.1 Herstellung von Gelatingelen 3.2.1.2 Gelatin-Zymographie mit Clostridium histolyticum-Kollagenase 3.2.2 Löslicher proteolytischer Assay mit Clostridium-histolyticum-Kollagenase 3.2.2.1 Einfluss der Kollagenasemenge auf die Kollagenspaltung 3.2.2.2 Nachweis von niedermolekularen Spaltprodukten durch Dünnschichtchromatographie 3.2.2.3 Nachweis von höhermolekularen Spaltprodukten bei niedrigeren Inkubationstemperaturen 3.2.2.4 Zeitabhängigkeit der Kollagenspaltung 3.2.2.5 Verschiedene Substrate im löslichen proteolytischen Assay 3.2.2.6 Einsatz von Inhibitoren im löslichen proteolytischen Assay 3.2.2.7 Densitometrische Quantifizierung von Kollagenbanden 3.3 Nachweis der DPP IV-Endopeptidase-Aktivität durch Gelatin-Zymographie 3.3.1 Einsatz der DPP IV-Präparation in den Zymographie-Assay 3.3.2 Einfluss von Elektrophoresebedingungen und Waschvorgang auf die Gelatinzymographie mit DPP IV 3.3.3 Einfluss von DPP IV-Menge und Inkubationsdauer auf die Gelatinolyse 3.4 Charakterisierung der DPP IV-Endopeptidase-Aktivität mit Hilfe des löslichen proteolytischen Assays 3.4.1 Einfluss der EDTA-Konzentration auf den löslichen proteolytischen Assay 3.4.2 Einfluss des pH auf die DPP IV-Endopeptidase-Aktivität 3.4.3 Einfluss der Inkubationstemperatur auf die DPP IV-Endopeptidase-Aktivität 3.4.4 Nachweis von Spaltprodukten durch Immunblotting 3.4.5 Untersuchungen zur Substrat-Spezifität der DPP IV-Endopeptidase-Aktivität 3.4.5.1 Natives Albumin, Fibronektin und Kollagen im löslichen proteolytischen Assay mit DPP IV 3.4.5.2 Die Spaltung denaturierten Kollagens der Typen I-V im Vergleich 3.4.6 Einfluss von Inhibitoren auf die DPP IV-Endopeptidase-Aktivität 3.4.6.1 Diprotin A und B 3.4.6.2 Aspartat-, Cystein-, Metallo- und Serinpeptidase-Inhibitoren 3.5 Untersuchungen zum DPP IV-Defizit deutscher Fischer-344-Ratten 3.5.1 Die DPP IV-Expression in Wistar- und Fischer-Ratten 3.5.1.1 Analyse der Con A-Eluate des Nierenrinden-Rohmembran-Solubilisats 3.5.1.2 Enzymhistochemie 3.5.2 Immunhistochemie 4 Diskussion 4.1 Die Spaltung von denaturiertem Kollagen durch DPP IV als Beweis der Endopeptidase-Aktivität 4.2 Ausschluss einer Kontamination 4.3 Die Spaltungsrate der DPP IV-Endopeptidase-Aktivität 4.4 Die Spaltprodukte der DPP IV-Endopeptidase-Aktivität 4.5 Die Spaltstellenspezifität der DPP IV-Endopeptidase-Aktivität 4.6 Die Substratspezifität der DPP IV-Endopeptidase-Aktivität 4.7 Das katalytische Zentrum der DPP IV-Endopeptidase-Aktivität 4.8 Die Kollagenbindungsdomäne der DPP IV 4.9 Mögliche biologische Funktionen der DPP IV-Endopeptidase-Aktivität 4.9.1 Beteiligung am Kollagenkatabolismus 4.9.2 Beteiligung an Zelladhäsionsprozessen 4.9.3 Beteiligung an der Translokation von Zellen 4.9.4 Beteiligung an der Resorption von prolinhaltigen Peptiden 4.9.5 Funktion in Leber, Speicheldrüsen, Pankreasgang und Prostata 4.10 Die DPP IV im Kontext anderer proteolytischer Enzyme 5 Literaturverzeichnis

Ergänzende Angaben:
Online-Adresse:	http://www.diss.fu-berlin.de/2002/191/index.html
Sprache:	Deutsch
Keywords:	dipeptidyl peptidase IV, DPP IV, endopeptidase, gelatin, collagen
DNB-Sachgruppe:	33 Medizin
Datum der Disputation:	13-Sep-2002
Entstanden am:	Fachbereich Humanmedizin, Freie Universität Berlin
Erster Gutachter:	Prof. Dr. med. Werner Reutter
Zweiter Gutachter:	Prof. Dr. med. Friedrich Körber
Kontakt (Verfasser):	bermpohl@gmx.de
Kontakt (Betreuer):	olibaum@zedat.fu-berlin.de
Abgabedatum:	18-Sep-2002
Freigabedatum:	18-Sep-2002

 

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