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FU Berlin
Digitale Dissertation

Jan Rathenberg :
Gezielte Genmodifikation und Single-Cell Elektroporation zur Analyse cholinerger Neuronen mittels Cholin Acetyltransferase als Marker
Gene targeting and single-cell electroporation to analyze cholinergic neurons using choline acetyltransferase as marker

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|Zusammenfassung| |Inhaltsverzeichnis| |Ergänzende Angaben|

Zusammenfassung

Cholinerge Neuronen benutzen den Neurotransmitter Acetylcholin (ACh) und sind an fundamentalen Gehirnfunktionen wie dem Lernen und Erinnern, Bewusstsein, dem Schlaf-Wach-Rhythmus wie auch der Muskelkontrolle beteiligt. Bei schweren neurodegenerativen Krankheiten wie Alzheimer oder Amyotropher Lateral Sklerose gehen cholinerge Nervenzellen verloren. Zur Identifikation cholinerger Neuronen setzt man immunhistochemische Methoden oder in situ Hybridisierung gegen das cholinerge Markerenzym Cholin Acetyltransferase (ChAT) ein. Diese Methoden erfordern allerdings die Fixierung des Gewebes, wodurch es nicht möglich ist, in vivo Experimente durchzuführen. Ein Ziel dieser Arbeit war, durch die Herstellung eines ChAT Fusionsproteins mit dem grün fluoreszierende Protein (GFP) zu ermöglichen, cholinerge Neuronen ohne Fixierung sichtbar zu machen. Hierfür wurde die cDNA von ChAT aus dem Rückenmark der Maus isoliert und nachfolgend die cDNA von GFP in eine einzelne HindIII Restriktionsschnittstelle kloniert, einem Sequenzbereich, der dem N-terminalen Ende des ChAT Proteins entspricht. Dieses ChAT-GFP Fusionsprotein wurde in COS-1 Zellen und Primärkultur hippokampaler Neuronen sowie in hippokampalen Neuronen organotypischer Gehirnschnittkulturen exprimiert. Es wurde gezeigt, dass das rekombinante ChAT-GFP Fusionsprotein eine geringfügig niedrigere spezifische Aktivität gegenüber dem Wildtypenzym besitzt. Es ist jedoch funktional und in Kulturzellen genauso wie das Wildtypprotein verteilt. In hippokampalen Neuronen diffundiert ChAT-GFP in axonale Verzweigungen und gelangt so an seinen Wirkungsort, die Präsynapse. Nachdem gezeigt wurde, dass ChAT-GFP in seiner Funktion vergleichbar dem Wildtypenzym ist, wurde die cDNA von GFP durch homologe Rekombination gezielt in das ChAT Gen embryonaler Stammzellen der Maus integriert. Diese ChAT(GFP/+) ES-Zellen wurden in Blastozysten injiziert. Aus diesem Blastozystentransfer gingen 14 chimäre Tiere hervor. Hetero- und homozygote Tiere, die aus ChAT(GFP/+) Stammzellen hervorgehen, werden das zuvor beschriebene ChAT-GFP Fusionsprotein in allen cholinergen Zellen exprimieren welche folglich eine endogene Fluoreszenz zeigen sollten. Parallel dazu wurde ein weiterer ES Zellklon hergestellt, bei dem das erste kodierende Exon von ChAT ?gefloxt" ist (Genotyp ChAT(loxP/+)). Durch konditionalen ?Knockout" kann dann das ChAT Gen entwicklungs- und gewebespezifisch in Mäusen ausgeschaltet werden. Ein weiteres Ziel war, die Kultivierung von organotypischen Gehirngewebeschnitten zu etablieren um später die Physiologie, Entwicklung und Degeneration cholinerger Neuronen untersuchen zu können. Dies soll u.a. durch gezielte Transfektion von cholinergen Neuronen in Gewebekultur erreicht werden. Aus diesem Grund wurde eine neue Methode, ?single-cell electroporation" oder SCE, zur Elektroporation von einzelnen Neuronen etabliert. Die Effizienz dieser Methode wurde um ein Vielfaches gesteigert. Mit SCE wurden neuronale Markerproteine in Pyramidenneuronen organotypischer, hippokampaler Gehirnschnitte exprimiert und mit der Verteilung von ChAT-GFP verglichen. Es wurde gezeigt, dass ChAT-GFP im Zytosol des Zellsomas, der dendritischen Spines und des Axons vorkommt und zumindest teilweise mit synaptischen Vesikeln assoziiert ist. Die Kombination aus genetischer Modifikation durch homologe Rekombination und direktem Gentransfer durch SCE ermöglicht neue Wege, die Signaltransduktion des cholinergen Systems auf molekularer Ebene zu analysieren.

Inhaltsverzeichnis

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0TITLE and APPENDIX

1INTRODUCTION

1.1 Organization of the cholinergic gene locus, mRNA transcription and translation

1.2 ChAT protein purification and characterization

1.3 The cholinergic synapse

1.4 The central and peripheral cholinergic nervous system

1.4.1 Anatomy

1.4.2 Development

1.4.3 Physiology

1.4.4 Disease

1.5 Organotypic cultures of neural tissue

1.6 Transfection of neurons by electroporation

1.7 In vivo imaging of the mammalian nervous system using fluorescent proteins

1.8 Cre/loxP mediated gene deletion or conditional gene "knock-out"

1.9 Creation of mutant mouse lines by homologous recombination

1.10 Aims of the project

2MATERIALS AND METHODS

2.1 Materials

2.1.1 Chemicals, reagents and consumable materials

2.1.2 Plasmid vectors

2.1.3 Bacteria strains, cell lines and animals

2.1.4 Primers and Oligonucleotides

2.1.5 Buffers and solutions

2.1.6 Media and solutions for bacteria, cell and tissue culture

2.2 Methods

2.2.1 Molecular Biology

2.2.1.1 Preparation of plasmid DNA

2.2.1.2 Determination of nucleic acid concentration

2.2.1.3 Sequence analysis

2.2.1.4 Digestion with restriction enzymes

2.2.1.5 Agarose gel electrophoresis

2.2.1.6 DNA fragment isolation

2.2.1.7 5´-Dephosphorylation

2.2.1.8 Ligation

2.2.1.9 Transformation

2.2.1.10 Preparation of competent cells

2.2.1.11 RNA preparation from mouse (C57Bl/6) spinal cord

2.2.1.12 Reverse transcription

2.2.1.13 Site-directed mutagenesis

2.2.1.14 PCR amplification of DNA fragments

2.2.1.15 PCR screen of ES cell clones in the 96 well format

2.2.1.16 Preparation of genomic ES cell DNA from 96 well culture plates

2.2.1.17 Southern transfer of DNA fragments onto membranes

2.2.1.18 Detection of PCR products of using the ECL system

2.2.1.19 Detection of genomic digestion fragments with radiolabeled

2.2.2 Biochemistry

2.2.2.1 Choline acetyltransferase activity assay

2.2.2.2 Determination of protein concentration

2.2.2.3 Protein gel electrophoresis

2.2.2.4 Staining of proteins in polyacrylamide gels

2.2.2.5 Western blotting and immunodetection

2.2.2.6 Fixation of cells and tissues

2.2.2.7 ChAT immuncytochemistry of transfected COS-1 cells

2.2.3 Cell culture

2.2.3.1 Transfection of COS-1 cells

2.2.3.2 ES cell culture

2.2.3.2.1 Preparation of feeder cells

2.2.3.2.2 Electroporation of ES cells

2.2.3.2.3 Picking of G418 resistant clones

2.2.3.3 Organotypic tissue culture

2.2.4 Electroporation of single neurons in brain slice cultures (SCE)

3RESULTS

3.1 Generation of expression and targeting vectors

3.1.1 ChAT-GFP and wildtype ChAT expression vectors

3.1.2 ChAT-GFP targeting vector

3.1.3 ChAT-loxP targeting vector

3.2 Functional characterization of the ChAT-GFP fusion protein

3.2.1 Expression of ChAT-GFP and wildtype ChAT

3.2.2 Enzyme activity of ChAT-GFP compared to the wildtype

3.2.3 Subcellular distribution of ChAT-GFP and wildtype ChAT in COS-1 cells

3.2.4 Subcellular distribution of ChAT-GFP in hippocampal neurons

3.3 Transfection of individual neurons in organotypic hippocampal slice cultures by single-cell electroporation (SCE)

3.4 Expression of presynaptic and postsynaptic marker proteins

3.5 Generation of ChAT-GFP and ChAT-loxP targeted mouse E14 stem cell

4DISCUSSION

4.1 A recombinant ChAT-GFP fusion protein has been generated which is efficiently expressed in COS-1 cells

4.2 Influence of GFP insertion in ChAT enzyme activity

4.3 Distribution of wildtype ChAT and ChAT-GFP in COS-1 cells

4.4 ChAT-GFP is expressed in pyramidal neurons and appears to be associated to synaptic vesicles

4.5 Establishing organotypic brain slice cultures

4.6 Improved single-cell electroporation (SCE) is a powerful transfection method for single neurons

4.7 Gene transfer of fluorescent proteins via SCE

4.8 Modification of the ChAT gene in ES cells by homologous recombination

4.9 Outlook

5SUMMARY

6ZUSAMMENFASSUNG

7ABBREVIATIONS

8REFERENCES

Ergänzende Angaben:

Online-Adresse: http://www.diss.fu-berlin.de/2002/194/index.html
Sprache: Englisch
Keywords: ChAT, GFP, gene targeting, single-cell electroporation, neuron
DNB-Sachgruppe: 32 Biologie
Datum der Disputation: 13-Sep-2002
Entstanden am: Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie, Freie Universität Berlin
Erster Gutachter: Priv.-Doz. Dr. Veit Witzemann
Zweiter Gutachter: Prof. Dr. Ferdinand Hucho
Kontakt (Verfasser): jrathenberg@web.de
Kontakt (Betreuer): witzeman@mpimf-heidelberg.mpg.de
Abgabedatum:19-Sep-2002
Freigabedatum:23-Sep-2002

 

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