Zusammenfassung
Gehirnkapillarendothelzellen bilden die Blut-Hirn-Schranke (BHS) und sind an der lateral-apikalen Membran über Tight junctions (TJs) verbunden. TJs haben eine besondere Bedeutung bei der Trennung benachbarter Kompartimente. Sie sind für die Funktion des jeweiligen Gewebes und die Aufrechterhaltung des Umgebungsmilieu lebensnotwendig. Störungen der BHS-Funktion sind Begleiterscheinungen vieler neurologischer Erkrankungen und resultieren oft aus einer Desintegration der TJ-Bestandteile. Viele TJ-Proteine wurden in den letzten Jahren identifiziert. Trotzdem ist die TJ-Struktur und der molekulare Mechanismus der TJ-Regulation unklar.
Gegenstand der Dissertation ist die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen dem transmembranen TJ-Protein Occludin und dem zytoplasmatischen Protein ZO-1. Angenommen werden neben Regulationsfunktionen von Occludin Rekrutierungsfunktionen von ZO-1. Durch eine genaue Analyse und molekulare Charakterisierung der in bioinformatischen Studien vorhergesagten Coiled coil-Bereiche in der Guanylatkinase-ähnlichen Domäne (Guk) und N-terminal angrenzender Regionen wurde dabei die Rolle und Funktion von ZO-1 als peripheres Membranprotein von TJs im Hinblick auf die Interaktion mit Occludin und einer Selbstassoziation betrachtet. Mittels Oberflächenplasmonresonanz-Spektroskopie wurde erstmals systematisch und in Echtzeit die Bindung zwischen ZO-1 und Occludin analysiert, die quantitativen Bindungsparameter bestimmt sowie die Spezifität der Bindung durch unabhängige Methoden bestätigt.
Erstens konnten Bindungsregionen des zytoplasmatischen C-terminalen Teils von Occludin auf CC2a in der Guk-Domäne von ZO-1 eingeschränkt werden. Diese Ergebnisse wurden durch ein Epitopmapping mit Occludin bestätigt. Für die Occludinbindung wurde eine Kernbindungsregion (AS 761-769) in CC2a aufgefunden.
Zweitens wurde erstmals ein Occludin-Bindungsepitop in der sogenannten Drehangelregion zwischen SH3- (src-homologe Domäne 3) und Guk-Domäne von ZO-1 nachgewiesen. Die Bindung von Occludin an diese Drehangelregion reguliert möglicherweise intra- und intermolekulare Wechselwirkungen von ZO-1 und induziert eine Di- oder sogar Oligomerisierung von ZO-1. Die Oligomerisierung von ZO-1 scheint ein wichtiger Faktor für den Einbau in den Makroproteinkomplex der TJs zu sein und das Rekrutierungspotential von ZO-1 für andere Proteine in den TJs erheblich zu erhöhen.
Die im C-terminalen Teil von Occludin vorausgesagten helikalen Abschnitte, die mit ZO-1 interagieren, bilden in wäßriger Lösung helikale Strukturen; ebenfalls wurde die Neigung der ZO-1-Peptidsequenzen CC1, CC2a und CC2b, helikale Strukturen auszubilden, durch CD-spektroskopische Untersuchungen bestätigt. Damit sind die strukturellen Erfordernisse für eine Bindung über Coiled coil-Strukturen in beiden Proteinen erfüllt. Die durchgeführten Untersuchungen liefern eine Basis zur Etablierung eines dreidimensionalen Modells eines Helixbündels der Occludin-ZO-1-Interaktion. |
