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FU Berlin
Digitale Dissertation

Eleonora Minina :
Interaktion der Ihh/Pthlh, BMP und FGF Signalwege in der Regulierung der Chondrozytenproliferation und Differenzierung
Ihh/Pthlh, BMP and FGF signaling in chondrogenesis
Interaction of Ihh/Pthlh, BMP and FGF signaling in regulating chondrocyte proliferation and differentiation

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|Zusammenfassung| |Inhaltsverzeichnis| |Ergänzende Angaben|

Zusammenfassung

Die Mehrzahl der Vertebratenknochen wird durch endochondrale Ossifikation gebildet. Während dieses Prozesses werden zunächst knorpelige Skelettelemente ausgebildet. Die Chondrozyten in der Knorpelanlage differenzieren in mehreren Schritten von proliferierenden zu hypertrophen Chondrozyten, die dann durch Knochengewebe ersetzt werden. Ein entscheidender Schritt in diesem Prozess ist die Regulation der Proliferation und der hypertrophen Differenzierung der Chondrozyten. Frühere Studien haben gezeigt, dass "Indian hedgehog" (Ihh) und "Parathyroid Hormone like Peptide" (Pthlh) die Chondrozytendifferenzierung in einem negativen "feed back loop" regulieren. Ihh, welches in prehypertrophen Chondrozyten exprimiert wird, aktiviert die Expression von Pthlh in der periartikulären Region sich entwickelnder Skelettelemente. Pthlh seinerseits aktiviert seinen Rezeptor (Pthr) in den proliferierenden und frühen hypertrophen Chondrozyten, wodurch das Einsetzen der Chondrozytendifferenzierung und damit die Expression von Ihh inhibiert wird. Ausserdem erwies sich Ihh als positiver Regulator der Chondrozytenproliferation. Neben dem Ihh/Pthlh Signalsystem spielen eine Anzahl weiterer Faktoren, beispielsweise "Bone Morphogenetic Proteins" (BMPs) und die "Fibroblast Growth Factors" (FGFs), eine bedeutende Rolle in der Chondrozytenentwicklung. Frühere Studien an Hühnergliedmassen haben gezeigt, dass ektopische Expression eines aktivierten BMP Rezeptors 1A die Expression von Pthlh hochreguliert und die Differenzierung der Chondrozyten blockiert. Dies hat zu der Hypothese geführt, dass BMPs "downstream" von Ihh agieren und die Aktivierung der Pthlh Expression vermitteln. Ziel dieser Arbeit war es, die Interaktion des Ihh/Pthlh Signalsystems mit BMP-Signalen näher zu untersuchen. Dabei wurde eine in vitro Kultivierungsmethode für Gliedmassen von Maus- und Hühnerembryonen etabliert, die die Untersuchung verschiedener Wachstumsfaktoren ermöglicht. Es konnte gezeigt werden, dass BMP-Signale nicht als Mediatoren des Ihh-Signals zur Regulation der Pthlh Expression dienen. Der BMP-Signalweg spielt jedoch bei verschiedenen anderen Schritten der Chondrozytendifferenzierung eine Rolle und interagiert mit dem Ihh-Signalweg auf unterschiedliche Weise. Zum einen regulieren sowohl BMP- wie auch Ihh-Signale die Chondrozytenproliferation, wobei beide Signale parallel agieren. Zweitens regulieren BMPs die Expression von Ihh und koordinieren damit die Chondrozytenproliferation und das Einsetzen der hypertrophen Differenzierung. Drittens verzögert der BMP-Signalweg die Differenzierung der terminalen hypertrophen Chondrozyten. FGFs bilden eine dritte Gruppe von Wachstumsfaktoren, die die Proliferation und die Differenzierung der Chondrozyten regulieren. Konstitutive Aktivierung des FGF Rezeptor 3 Gens (Fgfr3) führt zu den Zwergwuchssyndromen bei Mensch und Maus. Auf molekularer Ebene wurde gezeigt, dass Aktivierung des FGF-Signalwegs die Regionen der proliferierenden und differenzierenden Chondrozyten verkleinert. In dieser Arbeit wurden die epistatischen Beziehungen der FGF-Signale mit den Ihh/Pthlh- und BMP-Signalwegen untersucht. Die Aktivierung des FGF-Signalwegs in der Gliedmassenkultur hat eine herabgesetzte Chondrozytenproliferation und eine reduzierte Ihh Expression zur Folge, vergleichbar mit dem Phänotyp der Mausmodelle mit aktiviertem FGF-Signalweg (FGFach Maus). Ausserdem wirken FGF-Signale "upstream" des Ihh/Pthlh-System und steuern das Einsetzen der hypertrophen Differenzierung indirekt durch Regulierung der Ihh Expression. Im übrigen beschleunigen FGF-Signale den hypertrophen Differenzierungsprozess, anstatt ihn zu verzögern, wie in früheren Studien angenommen wurde. Da in Gliedmassenkulturen eine Aktivierung des FGF-Signalwegs einer Inhibierung von BMP Signalen gleicht, wurde die Interaktion von FGF und BMP Signalen untersucht. Beide Signalwege haben eine antagonistische Funktion während der Chondrozytenentwicklung. Ferner führt die Aktivierung von BMP-Signalen in FGFach Mäusen zu einer Anhebung der reduzierten Proliferationsrate und Ihh Expression und wirkt somit dem Zwergwuchsphänotyp entgegen. Aufgrund der Ergebnisse dieser Arbeit wurde ein Modell aufgestellt, welches drei Signalwege (Ihh/Pthlh, BMP und FGF), die die Proliferation und die Differenzierung der Chondrozyten regulieren, in ein gemeinsames Kontrollnetzwerk integriert.

Inhaltsverzeichnis

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TITLE PAGE AND SUMMARY
0. CONTENTS I
1. INTRODUCTION 1
1.1 Skeleton of vertebrates 1
1.2 Endochondral ossification 2
1.3 Structure of developing cartilage 4
1.4 Different signaling pathways regulating bone development 5
1.4.1 Human skeletal diseases 5
1.4.2 Ihh/Pthlh pathway directs endochondral ossification 7
1.4.3 BMP family 8
1.4.4 BMPs and Ihh may interact to regulate chondrocyte maturation 9
1.4.5 FGF signaling controls bone development 10
2. MATERIAL AND METHODS 13
2.1 Materials 13
2.1.1 Bacterial media 15
2.1.2 Limb-culture media 15
2.1.3 Reagents and buffers for in situ hybridization 16
2.1.4 Buffer for mice genotyping 17
2.1.5 Reagents and buffers for protein purification 17
2.1.6 Kits 19
2.1.7 Proteins 19
2.1.8 Table 1. Protein names and their synonyms 20
2.1.9 Table 2. Chicken and mouse DNA probes for in situ hybridization 21
2.1.10 Cell lines 22
2.1.11 Chicken and mouse lines 22
2.1.12 Bacterial strain 22
2.2 Methods 23
2.2.1 Genomic DNA preparation from mouse tail 23
2.2.2 Genotyping of mice 23
2.2.3 Limb culture 24
2.2.4 Harvesting and dehydration of limb tissue 25
2.2.5 BrdU labeling of limb explants 25
2.2.6 Silanization of slides 25
2.2.7 Preparation of DNA template for in vitro transcription 25
2.2.8 Labeling of antisense riboprobes 26
2.2.9 In situ hybridization 26
2.2.10 Washing of slides and dipping in photoemulsion 27
2.2.11 Production and purification of Noggin protein 27
2.2.12 Dot-blot hybridization for Noggin protein 28
3 RESULTS 29
3.1 Limb culture system 29
3.1.1 Concentration- and time-courses in the limb culture system 29
3.2 Ihh/Pthlh pathway 32
3.2.1 Ihh overexpression results in delayed chondrocyte differentiation 32
3.2.2 Modulation of Ihh signaling by Pthlh or cyclopamine in a limb culture 33
3.3 Interaction of BMP signaling and the Ihh/Pthlh pathway 34
3.3.1 BMP signaling regulates chondrocyte differentiation and proliferation 34
3.3.2 Bmp expression is upregulated in Ihh-overexpressing mice 36
3.3.3 BMPs are not mediators of Ihh signaling in regulating hypertrophic differentiation 36
3.3.4 Pthlh expression is not regulated by BMP signaling 38
3.3.5 BMPs and Ihh interact similarly in chick and in mouse 39
3.3.6 BMPs induces chondrocyte proliferation independent of Ihh 40
3.3.7 BMP signaling negatively regulates terminal hypertrophic differentiation 41
3.4 Interaction of FGF signaling with the Ihh/Pthlh pathway 43
3.4.1 FGF signaling regulates the chondrocyte differentiation and proliferation 43
3.4.2 FGFs advance hypertrophic differentiation by downregulating Ihh expression 45
3.4.3 FGF signaling regulates terminal hypertrophic differentiation independent of the Ihh/Pthlh system 47
3.4.4 FGF signaling reduces chondrocyte proliferation independent of Ihh/Pthlh 48
3.5 Interaction of FGF and BMP signaling 49
3.5.1 FGF signaling antagonizes BMP signal 49
3.5.2 BMPs rescue FGF-induced defects in achondroplasia mice 51
3.5.3 BMP and FGF signaling reciprocally regulate their expression 52
4 DISCUSSION 54
4.1 Analyzing of signaling systems using the limb culture system 54
4.2 Interaction of BMP signaling and the Ihh/Pthlh pathway 55
4.2.1 BMPs do not act as secondary signals of Ihh in regulating the onset of hypertrophic differentiation 55
4.2.2 BMP signaling regulates several aspects of chondrocyte development 57
4.2.3 The Bmp gene family 58
4.2.4 Interaction of BMP signaling with the Ihh/Pthlh pathway 59
4.3 Interaction of FGF and Ihh/Pthlh signaling 61
4.3.1 FGF signaling regulates bone development 61
4.3.2 FGF signaling accelerates hypertrophic differentiation 62
4.3.3 FGF and BMP signaling act as antagonists during cartilage development 64
4.3.4 BMP signaling rescues defects in achondroplasia mice 65
4.4 Conclusions 65
5 REFERENCES 67
6 APPENDIX 79
6.1 Abbreviations 79
6.2 Curriculum vitae 80
6.3 Publications and Meetings 81
6.4 Acknowledgments 82
6.5 Selbstständigkeitserklärung 83

Ergänzende Angaben:

Online-Adresse: http://www.diss.fu-berlin.de/2002/256/index.html
Sprache: Englisch
Keywords: Ihh, Pthlh, BMP, FGF, chondrogenesis
DNB-Sachgruppe: 32 Biologie
Datum der Disputation: 14-Jun-2002
Entstanden am: Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie, Freie Universität Berlin
Erster Gutachter: Prof. Dr. Günter Korge
Zweiter Gutachter: Prof. Dr. Roland Lauster
Dritter Gutachter: Prof. Dr. H. Kress, Prof. Dr. W. Schuster
Kontakt (Verfasser): minina@molgen.mpg.de
Kontakt (Betreuer): vortkamp@molgen.mpg.de
Abgabedatum:18-Nov-2002
Freigabedatum:27-Nov-2002

 

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