FU Berlin Digitale Dissertation
Ingo Tobias Lehmann : Proteinkinase Cα im Zellkern Kernimport, Interaktionspartner und Substrate Protein kinase Cα in the nucleus
|Zusammenfassung| |Inhaltsverzeichnis| |Ergänzende Angaben|

Zusammenfassung Die Isozyme der Proteinkinase-C-Familie sind Schlüsselmoleküle in der Signaltransduktion. Die klassische Isoform Proteinkinase Cα (PKCα) kann in den Zellkern translozieren und wahrscheinlich Einflüsse auf die Genexpression ausüben. Daher ist die Identifikation ihres Kernlokalisationssignals, ihrer Interaktionspartner und Substrate von besonderem Interesse. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde der Versuch unternommen, das in vorausgegangenen Arbeiten unseres Labors auf einen Teil der regulatorischen Domäne der PKCα eingegrenzte Kernlokalisationssignal (Wagner 1999) genauer zu definieren. Dazu wurden Zellen mit Expressionsvektoren transfiziert, die PKCα-Deletionsmutanten codierten, die mit GFP-β Galaktosidase bzw. mit zwei GFP-Molekülen fusioniert waren. Die erzielten Ergebnisse erlauben keine Aussage bezüglich der Präsenz eines NLS innerhalb der C1-Domäne der PKC, da die Fusionsproteine überraschenderweise eine ausgesprochen hohe Cytotoxizität aufweisen und in Aggregaten variabler Gestalt und Größe assemblieren. Offensichtlich können also in diesem Fall GFP-Konstrukte nicht zur Klärung der oben genannten Fragestellung verwendet werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde auf der Grundlage von Vorarbeiten unseres Labors (Rosenberger 1997) nachgewiesen, daß der PTB-assoziierte Spleißfaktor (PSF) ein Bindungs-partner für PKCα ist. Dabei handelt es sich um das erste nucleäre PKC-bindende Protein überhaupt. Die Bindung ist abhängig von der Aktivierung der PKCα. Desweiteren wurde festgestellt, daß PSF ein schwaches Substrat der PKCα ist. Bei der Suche nach weiteren Substraten der PKCα wurden in vitro-Phosphorylierungen von Kermembranen bzw. deren Triton X-100 resistenten Fraktionen durchgeführt und die Proteine anschließend mittels zweidimensionaler BAC-SDS-PAGE aufgetrennt. In der Auto-radiographie sichtbare Spots konnten aus den Gelen ausgestochen und mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie konnten 12 neue Substrate der PKCα zusätzlich zu dem bereits erwähnten PSF identifiziert werden. Darunter sind unter anderem mit dem Heterochromatin 2, dem Ott-Protein und einem putativen Protein drei neue Proteine identifiziert worden, die bislang nur aufgrund genetischer Daten in den Datenbanken zu finden waren und über deren Funktion demzufolge bislang nichts bekannt ist. Die biologischen Funktionen, die die anderen Proteine erfüllen, sind ebenso wie mögliche Bedeutungen ihrer Modifikation durch PKCα vielfältig. Sie erfüllen u.a. Aufgaben bei so wichtigen Prozessen wie Spleißen, beim mRNA-Export, bei der Chromatinorganisation, bei der Genregulation und bei der Ribosomenbiogenese.

Inhaltsverzeichnis Die gesamte Dissertation können Sie als gezippten tar-File oder als zip-File laden. Durch Anklicken der Kapitelüberschriften können Sie das Kapitel in PDF-Format laden: Titel und Inhaltsverzeichnis   1.   Einleitung 3 1.1.   Signaltransduktion zum Zellkern 3 1.2.  Der Zellkern 6 1.2.1. Die Kernmembran 6 1.2.2. Der Kernporenkomplex 9 1.2.3. Kernimport und Export 11 1.3. PKC im Zellkern 15 1.4. Substrate der PKC im Zellkern 17 1.5. Spleißen 19 1.6. Der PTB-assoziierte splicing Faktor (PSF) 20 1.7. Zielsetzung der Arbeit 22   2. Ergebnisse 24 2.1. Suche nach dem NLS der PKCα 24 2.1.1. Die pHMΔPKCα-Konstrukte 24 2.1.2. Die pHMΔPKCαDiGFP-Konstrukte 29 2.2. PSF als PKCα-bindendes Protein im Zellkern 35 2.2.1. Charakterisierung der verwendeten Antikörper 35 2.2.2. Untersuchung zum PTB-assoziierten Spleißfaktor (PSF) 36 2.3. Substrate der PKCα an der inneren Kernmembran 39 2.3.1. Phosphorylierung der Kernmembran 39 2.3.2. Phosphorylierung der Triton X-100-resistenten Fraktion der Kernmembran 42   3. Diskussion 44 3.1. Das Kernlokalisationssignal der PKCα 44 3.2. Physiologische Bedeutung der PSF-Bindung 49 3.3. Nucleäre Substrate der PKCα 52 3.4. Zusammenfassung 60 3.5. Ausblick 61 3.6. Summary 61   4. Material und Methoden 63 4.1. Analytik von Proteinen 63 4.1.1. Proteinbestimmung nach Bradford 63 4.1.2. Eindimensionale diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach Laemmli 63 4.1.3. BAC-SDS-PAGE 64 4.1.4. Blotting von Proteinen nach dem „Semidry“-Verfahren 66 4.1.5. Ponceaufärbung von Proteinen auf der Nitrozellulosemembran 66 4.1.6. SYPRO-Färbung von Proteinen auf der Nitrozellulosemembran 66 4.1.7. Nachweis von Proteinen durch Immunoblotting (Western-Blotting) 67 4.1.8. „Strippen“ der Blotmembran 68 4.1.9. Immunpräzipitation 68 4.1.10. Bindungstest („Pull down assay“) 69 4.1.11. Phosphorylierung von Proteinen (in vitro) 69 4.1.12. In Gel-Verdau mit Trypsin 70 4.2. Molekularbiologische Methoden 72 4.2.1. Anzucht von Bakterien 72 4.2.2. Herstellung kompetenter E. coli 72 4.2.3. Transformation kompetenter E. coli 73 4.2.4. Mini/Midi-Präparation von Plasmid-DNA 73 4.2.5. Ethanolfällung von DNA 74 4.2.6. Konzentrationsbestimmung von DNA 74 4.2.7. DNA-Spaltung mit Restriktionsenzymen 75 4.2.8. DNA-Ligation 75 4.2.9. Sequenzierung von DNA: 75 4.2.10. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) nach Arnheim und Ehrlich (1992) 76 4.2.11. Agarose-Gelelektrophorese 76 4.2.12. DNA-Elution aus Agarosegelen 77 4.2.13. Herstellung der Vektoren 77 4.3. Zellkultur 82 4.3.1. Sf9-Zellen 82 4.3.2. Transfektion von Sf9-Zellen 82 4.3.3. Bestimmung des Virustiters 83 4.3.4. Amplifikationsschritte und Expression des Fusionsproteins 84 4.3.5. Isolierung und Aufreinigung des GST-Fusionsproteins 85 4.3.6. Säugerzellen 86 4.3.7. Transfektion von Säugerzellen 86 4.3.8. Fluoreszenzmikroskopie 87 4.3.9. Subzelluläre Fraktionierung: Kernpräparation 87 4.3.10. Präparation von Kernmembranen und Nucleoplasma 88 4.3.11.  Tritonextraktion von Kernmembranen 89   5. Literatur 90   6. Anhang 101 6.1. Abkürzungen 101 6.2. Publikationen 102 6.3. Danksagungen 103

Ergänzende Angaben:
Online-Adresse:	http://www.diss.fu-berlin.de/2002/259/index.html
Sprache:	Deutsch
Keywords:	Protein kinase C; nucleus; signaltransduction; nuclear import; substrates, NLS
DNB-Sachgruppe:	30 Chemie
Datum der Disputation:	29-Oct-2002
Entstanden am:	Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie, Freie Universität Berlin
Erster Gutachter:	Prof. Dr. Ferdinand Hucho
Zweiter Gutachter:	PD Dr. Mathias Ziegler
Kontakt (Verfasser):	lehmanni@chemie.fu-berlin.de
Kontakt (Betreuer):	hucho@chemie.fu-berlin.de
Abgabedatum:	28-Nov-2002
Freigabedatum:	29-Nov-2002

 

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