Zusammenfassung
Der Transport von Post-Golgi-Vesikeln und deren Fusion mit der Plasmamembran sind die finalen Prozesse bei der konstitutiven Sekretion in lebenden Zellen. Der Transportweg zum Ort der Fusion dieser Vesikel mit der Plasmamembran wurde bisher nicht ausreichend untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurde Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIR-FM) genutzt, um Transport und Fusion von Post-Golgi-Vesikeln, wie auch von Vesikeln des endosomalen "Recycling" Kompartiments, zu untersuchen. TIR-FM is speziell dafür geeignet, fluoreszente Moleküle am Zell-Substrat-Übergang bildhaft darzustellen, weil die Kontaktfläche der Zelle selektiv angeregt wird.
Ein Ziel dieser Arbeit war es, eine quantitative Methode zur mikroskopischen Detektion einzelner Ereignisse bei der Exozytose zu etablieren. Aufbauend auf der Lokalisierung der Fusionen von Post-Golgi-Vesikeln wurden grundlegende offene Fragen auf dem Gebiet des Vesikeltransports beantwortet.
1. Mikroskopische Darstellung von Fusionsereignissen einzelner Post-Golgi-Transportvesikel. Ein TIR-FM-Systems wurde optimiert, um die Exozytose einzelner Post-Golgi-Vesikel zu detektieren. Indem die Vesikel mit einem Membranprotein (vesikuläre stomatische virale Glykoprotein, VSVG), gekoppelt an GFP, markiert wurden, konnten erstmalig quantitative Kriterien für die mikroskopische Detektion von einzelnen Fusionen etabliert werden. Durch quantitative Bildanalyse des zeitlichen Ablaufes konnten die Fusionen sowohl von der Bewegung relativ zur Plasmamembran als auch von der lichtinduzierten Lyse unterschieden werden. Der Einbau der Vesikelmembran in die Plasmamembran und die darauffolgende Diffusion der Membranproteine konnten zeitlich aufgelöst werden. Kleinere, sphärische und größere, tubuläre Vesikel wurden anhand der Dauer des vesikulären Einbauprozesses in die Plasmamembran unterschieden.
2. Funktion von Mikrotubuli im Post-Golgi-Vesikeltransport von Fibroblasten. Die gleichzeitige Beobachtung von Post-Golgi-Vesikeln und Mikrotubuli durch die Verwendung eines neuartigen Zweifarben-TIR-FM-Systems zeigte, daß die Vesikel an Mikrotubuli zum Ort ihrer Fusion transportiert werden. Dabei können die Vesikel noch zur Zeit der Fusion an die Mikrotubuli gebunden sein und müssen für die Fusion nicht notwendigerweise bis an das Ende der Mikrotubuli transportiert werden. Weiterhin zeigten unsere Ergebnisse, daß Exozytose von Vesikeln in wandernden Fibroblasten, im Gegensatz zu stationären Fibroblasten, bevorzugt in der Nähe des führenden Lamellipodiums ("leading edge") stattfindet. Nach Depolymerisierung der Mikrotubuli wurde dieser gerichtete Transport des Membranproteins (hier LDL-Rezeptor-GFP) unterbrochen und wandernde Fibroblasten konnten anhand der örtlichen Verteilung der Fusionen nicht mehr von stationären unterschieden werden. Die Depolymerisierung der Mikrotubuli führte außerdem zur Senkung der Fusionsfrequenz, zum Anstieg "unvollständiger" Fusionen und zum Anstieg der Menge an Membranproteinen, die während einzelner Fusionen an die Plasmamembran abgegeben wurden. Wir schließen daraus, daß Microtubuli für den gerichteten Transport von Membranproteinen in Post-Golgi-Vesikeln in Fibroblasten notwendig sind.
3. Funktion von Mikrotubuli im Post-Golgi-Vesikeltransport von polari-sierten Epithelialzellen. Mittels zeitaufgelöster Fluoreszenzmikroskopie habe wir den Transport von apikalen und basolateralen Membranproteinen zur Plasmamembran sowohl in unpolarisierten als auch in polarisierten Epithelialzellen untersucht. Unsere Resultate zeigten, daß in unpolarisierten Zellen sowohl apikale als auch basolaterale Post-Golgi-Vesikel an der basalen Zellmembran fusionieren. Nach Polarisation der Zellen fand die basale Exozytose beider Vesikel nicht mehr statt. Stattdessen fusionierten basolaterale Vesikel direkt zu Regionen an der lateralen Membran, während apikale Vesikel zur apikalen Plasmamembran transportiert wurden. Dieser selektive Transport fand nach der Polarisation der Zellen statt, parallel zur Umverteilung der t-SNAREs (Syntaxin 3 und 4). Weitere Ergebnisse zeigten, daß die exklusive Lokalisierung von Syntaxin 3 und apikalen Membranproteinen intakte Mikrotubuli benötigt. Im Gegensatz dazu, ist die gerichtete Exozytose von basolateralen Membranproteinen und die Verteilung von Syntaxin 4 und sec6 in polarisierten Zellen unabhängig von dem Zustand der Mikrotubuli.
4. Insulinabhängiges ?Recycling? des Glukosetransporters. Die insulin-abhängige Freigabe des Glukosetransporters GLUT4 vom endosomalen ?Recycling? Kompartiment (ERC für ?endosomal recycling compartment?) wurde untersucht. Die Ergebnisse zeigten, daß GLUT4 in Fibroblasten dynamisch in dem generellen ERC zurückgehalten wird, das auch den Transferrin-Rezeptor enthält. Mittels Zweifarben-TIR-FM demonstrieren wir, daß der Transferrin-Rezeptor und GLUT4 in separaten Vesikeln vom ERC zur Plasmamembran transportiert werden. Damit wurde der erste funktionellen Beweis für die Formation separater Vesikel vom ERC geliefert. Der langsame, insulinabhängige Transport der GLUT4-Vesikel kann dadurch erklärt werden, dass GLUT4 in Vesikel konzentriert wird, die sich langsamer bilden als Vesikel, die den Transferrin-Rezeptor beinhalten. |
