Zusammenfassung
Ruhende Leukozyten zirkulieren mit dem Blutstrom durch den Koerper, m¸ssen die Gefaesse jedoch verlassen, um ihre immunologische Funktion auszuueben. Die gezielte Auswanderung aus den Gefaessen waehrend Entzuendungsreaktionen und Lymphocyten-Rezirkulation wird durch das Zusammenspiel verschiedener leukozytaerer und endothelialer Adhaesionsmolekuele sowie proinflammatorischer Aktivatoren reguliert, die eine mehrstufige Adhaesionskaskase bilden. L-Selektin, ein Kohlehydrat-bindendes Adhaesionsmolekuel auf Leukozyten, vermittelt den ersten Schritt dieser Kaskade durch transienter Kontakt mit vaskulaeren Mucin-aehnlichen Adhaesionsmolekuelen. Diese Interaktion fuehrt zum langsamen Rollen der Leukozyten entlang der Gefaesswand, das die Vorraussetzung fuer die feste Anheftung der Blutzellen an das Endothel ist. Neben der Rolle bei der initialen Adhaesion aktiviert L-Selektin intrazellulaere Signalwege in Leukozyten und wird selbst durch Signale aus dem Inneren der Zelle in seiner Bindungsaktivitaet moduliert. Verstaerkte Bindung kann nach Chemokin-Behandlung oder zellulaere Aktivierung durch den T-Zell-Rezeptor beobachtet werden. Es wird vermutet, dass diese Aktivierung durch eine Phosphorylierung der zytoplasmatischen Domaene des Rezeptors an Serin-Resten verursacht wird. Obwohl zahlreiche zellulaere Signalwege bekannt sind, die von L-Selektin beeinflusst werden, sind die Vorgaenge auf der Ebene des Rezeptors unbekannt. Das Ziel dieser Arbeit war daher die Isolation intrazellulaerer Interaktionspartner von L-Selektin, die eine Rolle in der Signaluebermittlung spielen. Des weiteren sollten Kinasen identifiziert werden, die die Phosphorylieung des Rezeptors vermitteln.
Zu diesem Zweck wurde die Faehigkeit verschiedener Serin/Threonin Kinasen zur Phosphorylierung der cytoplasmatischen Domaene von L-Selektin getestet. Sowohl Protein Kinase C (PKC) als cGMP-abhaengige Protein Kinase (PKG) sind in der Lage, diese Sequenz als Substrat zu verwenden, waehrend Protein Kinase A keine Aktivitaet gegenueber diesem Protein besitzt.
Durch Affinitaetsreinigung wurde eine Kinase-Aktivitaet aus Zellysaten isoliert, die fest an die zytoplasmatische Domaene von L-Selektin bindet und diese an Serin-Resten phosphoryliert. Inhibitorstudien zeigten, dass diese Kinase durch spezifische PKC-Antagonisten hemmbar ist. Durch Immunodetektion konnten zwei PKC-Isozyme nachgewiesen werden, die mit einem Lscyto Fusionsprotein assozierten: neuartige PKCq und atypische PKCl.
Die Suche nach Interaktionspartnern, die spezifisch an die Serin-phosphorylierte Form von L-Selektin binden, fuehrte zu Isolation zweier Proteine, die als konventionelle PKCa und wiederum PKCq identifiziert wurden. PKCq bindet phosphorylieres L-Selektin in staerkerem Ausmass als das nicht-modifizierte Protein. Sowohl PKCa als auch PKCq co-immunpraezipitieren mit L-Selektin aus PMA-behandelten T-Zell-Lysaten, was zeigt, dass diese Interaktion in intakten Zellen stattfindet.
Diese Untersuchung zeigt, dass eine Isozym-spezifische Assoziation von PKC mit L-Selektin stattfindet und dass diese Interaktion durch Serin-Phosphorylierung des Rezeptors reguliert wird. Dies deutet darauf hin, dass PKC die zellulaere L-Selektin-Kinase ist und dass diese Kinase eine zentrale Rolle in Signal-Uebertragungvorgaengen des Rezeptors spielt. |
