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FU Berlin
Digitale Dissertation

Hanka Symmank :
Funktionelle und strukturelle Charakterisierung bakterieller Peptidsynthetasen
Peptid-Engineering durch kombinatorische Manipulation der Surfactin-Synthetase
Functional and structural characterization of bacterial peptide synthetases

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|Zusammenfassung| |Inhaltsverzeichnis| |Ergänzende Angaben|

Zusammenfassung

Infolge ihres modularen Organisationsprinzips verfügen die Nichtribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS) über ein enormes Potential bei der Entwicklung innovativer neuer Wirkstoffe. Allerdings führte die Vernachlässigung interdomänischer Wechselwirkungen beim Protein-Engineering in der Vergangenheit zu zahlreichen Mißerfolgen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, den Einfluß unterschiedlicher Rekombinationsstrategien auf die einzelnen Enzymfunktionen systematisch zu untersuchen und so das nötige Rüstzeug für die biokombinatorische Neuverknüpfung der NRPS bereitzustellen. Alle Module setzen sich aus wiederkehrenden funktionellen Domänen zusammen, die für die Adenylierung (A), Thioesterbindung (T) und Kondensation (C) der Peptidaminosäuren verantwortlich sind. Als Trägern der Substratspezifität kommt den A-Domänen eine Schlüsselrolle zu, der mit der detaillierten Analyse von zwei Mitgliedern der adenylatbildenden Familie Rechnung getragen werden sollte. Zum einen wurde dafür die autonom arbeitende Acetyl-CoA-Synthetase aus Lysobacter sp. ATCC 53042 gewählt, bei der nicht nur eine außergewöhnlich hohe Carbonsäuretoleranz festgestellt wurde, sondern überdies in Abhängigkeit von der Liganden-Kombination beachtliche Differenzen zwischen den Hin- und Rückreaktionen der zweistufigen Acyl-CoA-Synthese existierten. Zum anderen wurde das erste Modul Srf-M1 der Surfactin-Synthetase aus B. subtilis ATCC 21332 charakterisiert, das außer seinem Hauptsubstrat L-Glutaminsäure keine andere Aminosäure erkannte und aktivierte. Es besitzt zwei protease-sensitive Regionen, die genau der Scharnierregion zwischen den A-Subdomänen sowie dem Übergang von der C- zur A-Domäne entsprechen und vermutlich die Hauptursache für das Scheitern umfangreicher Kristallisationsversuche sind. Im Hinblick auf das Hauptanliegen wurden nunmehr systematisch verschiedene Surfactin-Synthetase-Abschnitte und -Module neu miteinander verknüpft und der Einfluß der verschiedenen Rekombinationsstrategien untersucht. Als Modellenzyme wurden sowohl monomodulare Hybride aus den L-Valin- bzw. L-Leucin-aktivierenden Modulen Srf-M4 und Srf-M7 als auch bimodulare Hybridsynthetasen aus den L-Glutaminsäure- bzw. D-Leucin-aktivierenden Modulen Srf-M1 und Srf-M3 der trimodularen Surfactin-Synthetase SrfA-A konstruiert, wobei die Fusionen innerhalb aller drei Domänentypen A, T und C vorgenommen wurden. Von allen untersuchten Fusionsstellen ergab nur die Rekombination innerhalb des hochkonservierten His-Motivs eine voll funktionsfähige Peptidsynthetase, dagegen konnten bei anderen Manipulationen wie z.B. in der Scharnierregion der beiden A-Subdomänen oder im hochkonservierten T-Motiv nur noch Teilfunktionen nachgewiesen werden. Nach Entfernung einer kompletten Moduleinheit produzierte die hybride Surfactin-Synthetase von B. subtilis R13CDM in vivo entsprechend ihrer neuen Programmierung nur noch ein Lipohexapeptid. Es wäre vorstellbar, daß dieses Derivat vor allem wegen seiner geringeren Erythrocytentoxizität eine geeignete Alternative für das Wildtyp-Surfactin werden könnte.

Inhaltsverzeichnis

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Titelblatt

Abkürzungsverzeichnis

1 Einleitung und Problemstellung

2 Grundlagen und Theorie

2. 1 Modulare Organisation der nichtribosomalen Peptidsynthetasen

2. 2 Der Multienzym Thiotemplate Mechanismus

2. 3 Die funktionellen Domänen der nichtribosomalen Peptidsynthetasen

2. 4 Die Surfactin-Synthetase

3 Material

3. 1 Mikroorganismen

3. 2 Plasmide

3. 3 Primer für die Polymerasekettenreaktion

3. 4 Chemikalien, Enzyme, Kits und Größenmarker

3. 5 Apparative Ausstattung und sonstige Materialien

3. 6 Medien, Agarplatten und Antibiotika

3. 7 Puffer und Lösungen

4 Methoden

4. 1 Aufbewahrung und Anzucht von Bakterien

4. 2 Methoden zur Isolierung, Analyse, Amplifikation und Rekombination von DNA

4. 3 Methoden zur Isolierung und Charakterisierung von Proteinen

4. 4 In vitro-Bestimmung enzymatischer Aktivitäten

4. 5 In vivo-Biosynthese von Surfactin und -analoga

4. 6 Synthese von 3-Hydroxytetradecanoyl-Coenzym A

4. 7 Kristallisationsansätze

5 Ergebnisse

5. 1 Enzymatische Charakterisierung der Acetyl-CoA-Synthetase von Lysobacter sp. ATCC 53042

5. 2 Enzymatische und strukturelle Charakterisierung der A-Domäne des Glutaminsäure-aktivierenden Startmoduls der Surfactin-Synthetase Srf-M1

5. 4 In vivo-Rekombination von Surfactin-Synthetase-Genen in B. subtilis und Charakterisierung der resultierenden Deletions- und Austauschmutanten der Surfactin-Synthetase

6 Diskussion

7 Literatur

8 Anhang

9 Veröffentlichungen und Präsentationen

Ergänzende Angaben:

Online-Adresse: http://www.diss.fu-berlin.de/2002/75/index.html
Sprache: Deutsch
Keywords: peptide synthetases, peptide engineering, novel surfactin, surfactin synthetase
DNB-Sachgruppe: 30 Chemie
Datum der Disputation: 19-Apr-2002
Entstanden am: Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie, Freie Universität Berlin
Erster Gutachter: Prof. Dr. Wolfram Saenger
Zweiter Gutachter: Prof. Dr. Joachim Vater
Kontakt (Verfasser): hsymmank@web.de
Kontakt (Betreuer): fbern@bpc.uni-frankfurt.de
Abgabedatum:10-May-2002
Freigabedatum:13-May-2002

 

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