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FU Berlin
Digitale Dissertation

Stephanie Wälter :
Untersuchung der Huntingtinaggregation in Säugetierzellen und Identifizierung von HIP1-interagierenden Proteinen
Analysis of huntingtin aggregation in mammalian cells and identification of HIP1-interacting proteins

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|Zusammenfassung| |Inhaltsverzeichnis| |Ergänzende Angaben|

Zusammenfassung

Chorea Huntington (HD) ist eine vererbte, fortschreitend verlaufende neurodegenerative Krankheit, die durch eine verlängerte Polyglutaminkette am N-Terminus des Proteins Huntingtin verursacht wird. Der Pathomechanismus von HD sowie die normale Funktion von Huntingtin sind unklar. HD Exon 1 Proteine mit einer Glutaminkettenlänge im krankhaften Bereich (> 37 Glutamine) bilden in vitro Proteinaggregate. Außerdem wurde die Anhäufung von unlöslichen, Polyglutamin-enthaltenden Proteinaggregaten in Hirnen von HD transgenen Mäusen und Patienten detektiert, was zu der Hypothese führte, daß HD durch die Bildung von Proteinaggregaten in neuronalen Einschlußkörpern verursacht wird. Um die Aggregation von Huntingtin genauer zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit stabile, induzierbare 293 Tet-Off Zelllinien hergestellt, die HD Exon 1 Proteine mit 20, 51 und 83 Glutaminen produzieren. In diesem Zellmodell bilden Huntingtin Exon 1 Proteine mit einer Glutaminkettenlänge im krankhaften Bereich (51 und 83 Glutamine), aber nicht mit einer Kettenlänge im normalen Bereich (20 Glutamine), perinukleare Einschlußkörper. Diese Strukturen enthalten aggregiertes, ubiquitiniertes Huntingtin Exon 1 Protein mit einer fibrillären Morphologie. Die Einschlußkörper werden an Centrosomen gebildet und von dem Intermediärfilament Vimentin umhüllt. Immunfluoreszenz und Elektronenmikroskopie zeigten, daß die 20S, 19S und 11S Untereinheiten des 26S Proteasoms, die molekularen Chaperone BiP, Hsp70 und Hsp40 sowie das RNA-bindende Protein TIA-1, das potentielle Chaperon 14-3-3 und a-Synuclein mit den perinuklearen Einschlußkörpern colokalisieren. Die Inhibierung der proteasomalen Aktivität führte zu einem zweifachen Anstieg der Aggregatmenge, was zeigt, daß sich die Einschlußkörper anhäufen, wenn die Kapazität des Ubiquitin-Proteasom Systems erschöpft ist. In den 293 Tet-Off Zellen führte die Bildung der Einschlußkörper auch zu Zelltoxizität und ultrastrukturellen Veränderungen wie Einbuchtungen und Unterbrechungen in der Kernmembran. Zusammengenommen legen diese Befunde nahe, daß HD Exon 1 Fragmente unter normalen Bedingungen vom Proteasom abgebaut werden. HD Exon 1 Fragmente mit einer langen Polyglutaminkette polymerisieren jedoch und widerstehen dem Abbau; sie rekrutieren sogar noch zusätzliche Proteine zu den Einschlußkörpern und bilden das "Degrasom". Um etwas über die normale Funktion von Huntingtin zu erfahren, haben wir mit dem Hefe Two-Hybrid System nach Huntingtin-interagierenden Proteinen gesucht und dabei das Huntingtin interagierende Protein 1 (HIP1) identifiziert. Hier wird gezeigt, daß HIP1 ein Multidomänenprotein ist, das eine N-terminale ENTH-Domäne, eine zentrale coiled-coil-bildende Region und eine C-terminale Actin-bindende Domäne enthält. Mittels Affinitätschromatographie wurden drei HIP1 assoziierte Proteine identifiziert: die schwere Kette von Clathrin, a-Adpatin A und C. In vitro Bindungsstudien zeigten, daß die zentrale coiled-coil-bildende Domäne für die Interaktion von HIP1 mit Clathrin benötigt wird, während DxF-Motive, die vor dieser Domäne liegen, für die Bindung von HIP1 an die C-terminale "Appendage"-Domäne von a-Adaptin A und C wichtig sind. Die Expression des vollständigen HIP1 in Säugetierzellen ergab eine punktförmige, cytoplasmatische Immunfärbung, die für Clathrin-bedeckte Vesikel charakteristisch ist. Wenn ein verkürztes HIP1 Protein überexprimiert wurde, das die DxF-Motive und die coiled-coil Domäne enthält, wurden jedoch große, perinukleare vesikelartige Strukturen beobachtet, die HIP1, Huntingtin, Clathrin und internalisiertes Transferrin enthielten, was darauf hinweist, daß HIP1 ein endocytotisches Protein ist. Die strukturelle Vollständigkeit von HIP1 scheint somit für die Erhaltung der Vesikelgröße in vivo entscheidend zu sein.

Inhaltsverzeichnis

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  Titelblatt, Inhaltsverzeichnis  
1. Einleitung 1
2. Untersuchung der Aggregatbildung von HD Exon 1 Proteinen in Säugetierzellen 3
2.1 Ergebnisse 7
2.1.1 Herstellen von stabilen Zelllinien 7
2.1.2 Bestimmung der optimalen Doxycyclinkonzentration 8
2.1.3 Bestimmung der optimalen Induktionszeit 10
2.1.4 Die Expression von HD Exon 1 Proteinen mit langen Polyglutaminketten führt zur Bildung von ubiquitinierten Aggregaten
 11
2.1.5 Zeitabhängigkeit der Aggregatbildung 13
2.1.6 Die Expression von HD Exon 1 Proteinen mit langen Polyglutaminketten führt zur Bildung von perinuklearen Aggregaten
 14
2.1.7 Cytoplasmatische Aggregate colokalisieren mit dem Centrosom und führen zur zellulären Umverteilung von Vimentin
 15
2.1.8 Colokalisation des Proteasoms mit HD Exon 1 Aggregaten 17
2.1.9 Die Inhibierung des Proteasoms verstärkt die Aggregationsbildung 18
2.1.10 Rekrutierung des ER-Chaperons BiP/Grp78 in die perinuklearen Einschlußkörper
 20
2.1.11 Colokalisierung von TIA-1, 14-3-3e und a-Synuclein 22
2.1.12 Ultrastruktur der perinuklearen Einschlußkörper 24
2.1.13 Die Expression von mutierten Huntingtinproteinen ist toxisch für 293 Tet-Off Zellen
 27
2.2. Diskussion 27
3. Identifizierung und Charakterisierung von HIP1-interagierenden Proteinen
 37
3.1 Ergebnisse 37
3.1.1 Strukturanalyse von HIP1 37
3.1.2 Affinitätsreinigung von HIP1-interagierenden Proteinen 39
3.1.3 Identifizierung der HIP1-interagierenden Proteine durch Massenspektrometrie und Immunblotting
 39
3.1.4 HIP1 Fragmente, die DxF-Motive enthalten, assoziieren direkt mit der a-Adaptin "Appendage"-Domäne
 43
3.1.5 Die coiled-coil-bildende Domäne in HIP1 ist entscheidend für die Bindung an die schwere Kette von Clathrin
 45
3.1.6 HIP1 ist mit Clathrin-bedeckten Vesikeln assoziiert 46
3.1.7 Die Überexpression von HIP1 (218-604) in COS-1 Zellen induziert die Bildung von großen vesikelartigen Strukturen
 48
3.2 Diskussion 51
4. Materialien und Methoden 57
4.1 Materialien 57
4.1.1 Bakterienstämme 57
4.1.2 Zelllinien 57
4.1.3 Plasmidvektoren 58
4.1.4 Medien und Puffer 60
4.1.5 Oligonukleotide 61
4.1.6 Antikörper 63
4.1.7 Enzyme, Proteine und DNA 64
4.1.8 Chemikalien und Säulenmaterialien 65
4.1.9 Kits 67
4.1.10 Laborausstattung, Geräte und Zubehör 67
4.2 Methoden 70
4.2.1 Grundlegende molekularbiologische Methoden 70
4.2.1.1 DNA-Plasmidpräparation mit Qiagen-Kits 70
4.2.1.2 DNA-Plasmidpräparation über CsCl-Gradient 71
4.2.1.3 Konzentrationsbestimmung der DNA 72
4.2.1.4 Restriktionsverdau von DNA 72
4.2.1.5 Dephosphorylierung von 5´-Phosphatgruppen 72
4.2.1.6 Aufreinigung von DNA-Fragmenten 73
4.2.1.7 DNA Agarose-Gelelektrophorese 73
4.2.1.8 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 74
4.2.1.9 Ligation von DNA-Fragmenten 74
4.2.1.10 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 75
4.2.1.11 DNA-Sequenzierung 75
4.2.1.12 Plasmidkonstruktionen 76
4.2.1.12.1 pTet-CMV-Hyg-CAG20, -CAG51 und -CAG83 76
4.2.1.12.2 HIP1-Plasmide 76
4.2.1.12.2.1 pTL1-HIP1 (218-604) 76
4.2.1.12.2.2 pGEX-HIP1 (218-604) 76
4.2.1.12.2.3 pGEX-6P-1-HIP1, pQE32-HIP1 und pTL1-HA3-HIP1 (1-1003), (1-604), (1-333), (1-217), (218-604) und (334-604)
 76
4.2.1.12.3 pGEX-a-Adaptin 77
4.2.1.12.4 pSE111 Helferplasmid für Proteinexpression 77
4.2.2 Grundlegende mikrobiologische Methoden 78
4.2.2.1 Herstellung elektrokompetenter Zellen 78
4.2.2.2 Transformation kompetenter Bakterien mittels Elektroporation 78
4.2.2.3 Kultivierung und Lagerung von transformierten Bakterien 79
4.2.3 Grundlegende proteinbiochemische Methoden 79
4.2.3.1 Expression von rekombinanten GST-Fusionsproteinen in E. coli 79
4.2.3.2 Reinigung von rekombinanten GST-Fusionsproteinen 80
4.2.3.3 Reinigung von rekombinanten His-Fusionsproteinen unter nativen Bedingungen
 80
4.2.3.4 Reinigung von rekombinanten His-Fusionsproteinen unter denaturierenden Bedingungen
 81
4.2.3.5 Konzentrationsbestimmung von Proteinlösungen 82
4.2.3.6 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 82
4.2.3.7 Coomassie-Färbung von SDS-Gelen 83
4.2.3.8 Western Blot 84
4.2.3.9 Filtertest 85
4.2.3.10 Proteinbindungstest und Peptidkompetitionsstudien 86
4.2.3.11 Protein Overlay-Assay 86
4.2.3.12 Aufreinigung von Clathrin-bedeckten Vesikeln 87
4.2.3.13 Immunmarkierung der Clathrin-bedeckten Vesikel für elektronenmikroskopische Untersuchungen
 87
4.2.4 Grundlegende zellbiologische Methoden 88
4.2.4.1 Auftauen von kryokonservierten Säugetierzellen 88
4.2.4.2 Kultivierung und Lagerung von Säugetierzellen 88
4.2.4.3 Trypsinieren von Säugetierzellen 89
4.2.4.4 Bestimmung der Zellkonzentration von kultivierten Säugetierzellen 89
4.2.4.5 Transfektion von Säugetierzellen 89
4.2.4.6 Herstellung der stabilen, induzierbaren Tet-Off Zellen 90
4.2.4.7 Herstellung von Zelllysaten 90
4.2.4.8 Vorbereitung von Zellpräparaten für die Immunfluoreszenzmikroskopie 91
4.2.4.9 Vorbereitung von Zellpräparaten für die Elektronenmikroskopie 92
4.2.4.10 Inhibierung des Proteasoms mit Lactacystin 93
4.2.4.11 Toxizitätstest 93
4.2.5 Grundlegende immunologische Methoden 93
4.2.5.1 Herstellung von polyklonalen Antikörpern 93
4.2.5.2 Affinitätsreinigung von polyklonalen Antikörpern 94
4.2.5.3 IgG-Präparation aus Antiserum 94
4.2.6 Massenspektrometrie 95
4.2.6.1 Aufbereitung der Gelprobe 95
4.2.6.2 MALDI-TOF-MS Probenvorbereitung und Analyse 95
5. Literaturverzeichnis 97
6. EigenePublikationen 108
7. Abkürzungen 109
8. Danksagung 112
9. Zusammenfassung 113
10. Abstract 115

Ergänzende Angaben:

Online-Adresse: http://www.diss.fu-berlin.de/2003/41/index.html
Sprache: Deutsch
Keywords: Huntington`s Disease, huntingtin, aggresome, huntingtin-interacting protein 1, endocytosis
DNB-Sachgruppe: 32 Biologie
Datum der Disputation: 13-Aug-2002
Entstanden am: Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie, Freie Universität Berlin
Erster Gutachter: Prof. Dr. Erich E. Wanker
Zweiter Gutachter: Prof. Dr. Werner Reutter
Kontakt (Verfasser): s.waelter@mdc-berlin.de
Kontakt (Betreuer): ewanker@mdc-berlin.de
Abgabedatum:14-Feb-2003
Freigabedatum:24-Feb-2003

 

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