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FU Berlin
Digitale Dissertation

Christoph Wissmann :
Identifizierung differentiell exprimierter Gene in Tumoren der Prostata und Harnblase
Identification of differential expressed genes in tumors of the prostate and bladder

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|Zusammenfassung| |Inhaltsverzeichnis| |Ergänzende Angaben|

Zusammenfassung

Das Prostatakarzinom ist der häufigste maligne Tumor des Mannes. Sein Auftreten, vor allem im hohen Alter, rückt ihn bei einer steigenden Lebenserwartung der Bevölkerung weiter in den Mittelpunkt des Interesses. Zur Analyse dieses Tumors wurde das Expressionsprofil des Tumor- und Normalgewebes von 54 Prostatapatienten durch Affymetrix-Chiphybridisierungen untersucht. Aus den mikrodissezierten Tumor- und Normalgeweben wurde die Poly-A+-RNA präpariert und in aufeinander folgenden Runden von cDNA-Synthese und in vitro Transkription linear amplifiziert. Die Chipdaten der 108 Patientengewebe wurden mit einem speziell entwickelten Algorithmus ausgewertet und führte zur Identifikation von 124 in Prostatatumoren herunterregulierten und weiteren 104 in Tumoren hochregulierten Sequenzen, die in einer Gruppenanalyse (Clusteranalyse) untersucht wurden. Die Clusteranalyse zeigte eine deutliche Trennung der Tumor- von ihren korrespondierenden Normalgeweben mit einer Sensivität von 94% bei einer Spezifität von 72%. Eine Auftrennung der Gewebe entsprechend ihrer histologischen Klassifikationen wie auch eine Gruppierung der Tumorproben entsprechend ihres Grades und Stadiums war nicht in allen Fällen möglich, da die histologischen Merkmalen nicht eindeutig mit den molekularen Profilen übereinstimmten. Für eine nähere Untersuchung wurden aus der Liste der in den Prostatatumoren herunterregulierten Gene drei ausgesucht und ein viertes auf Grund einer ähnlichen Funktion ausgewählt. Die Herunterregulation des WIF-1 in den Prostatatumoren war sehr deutlich und konnte auch in Brust- und Lungentumoren gezeigt werden. Die Ursache der Herunterregulation ist unbekannt, da WIF-1 in der Region 12q14.3 lokalisiert ist, für die in Prostatatumoren bisher noch keine chromosomalen Aberrationen identifiziert wurden. Immunhistochemische Färbungen von Prostata- und Harnblasentumoren konnten den Verlust der Expression in einem Teil der Tumoren bestätigen. Aus dem Signalweg der Wnt-Proteine konnte das sFRP1 als ein weiteres Gen, mit einer ähnlichen Funktion wie WIF-1, auf dem Chip identifiziert werden. sFRP1 zeigte keine Regulation in Prostatatumoren, ist jedoch in der häufig in Harnblasentumoren verlorenen Region 8p11.22 lokalisiert. Die reduzierte Genexpression in Blasentumoren konnte in Northern-Hybridierungen gezeigt werden und LOH-Untersuchungen bestätigten den häufigen Verlust der Region. Immunhistochemische Untersuchungen mit einem sFRP1-Antikörper zeigten den Verlust der Expression in 26% der untersuchten Harnblasentumore. Als drittes Gen mit einer Herunterregulation in Prostatatumoren wurde das Chimerin-1 ausgewählt, das eine hemmende Wirkung auf die Signalweiterleitung Ras-ähnlicher Rho-Proteine hat. Auch für dieses Gen konnte die differentielle RNA-Expression bestätigt werden. Für das Adaptorprotein Ponsin konnte die differentielle Expression in RNA-Studien bestätigt werden, die Proteinexpression zeigte sich jedoch nicht als differentiell zwischen Normal- und Tumorepithelien, sondern wies auf ein methodisches Problem der manuellen Mikrodissektion hin. Auch konnte in einer LOH-Untersuchung kein signifikanter Hinweis auf einen Verlust des Gens gefunden werden.

Inhaltsverzeichnis

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0. Titelblatt und Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 1
1.1 Epidemiologie und Diagnostik des Prostatakarzinoms 2
1.2 Überblick über das Harnblasenkarzinom 7
1.3 Wnt- und Ras-Signaltransduktionswege 9
1.4 Auswahl von Methoden zur Bestimmung der differentiellen mRNA-Expression 11
2. Zielsetzung 16
3. Material und Methoden 17
3.1 Puffer und Lösungen 17
3.2 Plasmidisolierung 18
3.3 DNA und RNA Quantifizierung mit PicoGreen bzw. RiboGreen 19
3.4 Sequenzierung 19
3.5 Isolierung von spezifischen BAC-Klonen 21
3.6 Northern Hybridisierungen 22
3.7 Mikrodissektion 25
3.8 Poly-A+-RNA Präparation 26
3.9 cDNA Synthese 27
3.10 Affymetrix Chipexperimente 32
3.11 Quantitative "TaqMan" PCR 35
3.12 LOH-Untersuchung 37
3.13 In silico Analysen 41
3.14 Proteinchemische Methoden 43
4. Ergebnisse 48
4.1 Affymetrix Chipauswertung von 54 Patienten mit Prostataumoren und Prostatazelllinien 48
4.2 Analyse an Hand des Expressionsprofils ähnlich gruppierter Versuche und Gene 56
4.3 Kandidatengene aus dem Wnt-Signalweg 63
4.4 Chimerin-1, ein Kandidatengen aus dem Ras-Signalweg 75
4.5 Kandidatengen Ponsin 79
5. Diskussion 93
5.1 Methodische Aspekte der Expressionsuntersuchung von Prostatageweben 93
5.2 Clusteranalyse der Expressionsprofile von Prostatanormal-und tumorgeweben 96
5.3 Auswahl von herunterregulierten Genen in Tumoren der Prostata 100
6. Zusammenfassung 111
7. Summary 113
8. Literatur 115
9. Anhang 127
9.1 Histologie der 54 untersuchten Prostatagewebepaare 127
9.2 Danksagung 129
9.3 Lebenslauf 130
9.4 Erklärung 131

Ergänzende Angaben:

Online-Adresse: http://www.diss.fu-berlin.de/2003/5/index.html
Sprache: Deutsch
Keywords: expression profiling, prostate and bladder cancer, WIF-1
DNB-Sachgruppe: 32 Biologie
Datum der Disputation: 19-Dec-2002
Entstanden am: Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie, Freie Universität Berlin
Erster Gutachter: Prof. Dr. Volker A. Erdmann
Zweiter Gutachter: Prof. Dr. André Rosenthal
Kontakt (Verfasser): christoph.wissmann@charite.de
Kontakt (Betreuer): erdmann@chemie.fu-berlin.de
Abgabedatum:21-Jan-2003
Freigabedatum:22-Jan-2003

 

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