| Identifizierung und Untersuchung von apoptose-assoziierten Proteinen mit proteom-analytischen Methoden |
Schlüsselwörter:
apoptosis, epithelial cells, mass spectrometry, two-dimensional gel electrophoresis, keratin,
Apoptose, Epithelzellen, Massenspektrometrie, zweidimensionale Gelelektrophorese, Keratin
Sachgruppe der DNBAbstract
The knowledge of the proteome, the proteins expressed by the genome, provides information on (i) if and when predicted gene products are translated, (ii) the relative concentrations of gene products, and (iii) the extent of post-translational modifications, none of which can be accurately predicted from the DNA alone. In this study, proteome analysis was used to investigate the phenomenon of apoptosis (programmed cell death) on the protein level. Since the molecular mechanisms underlying the process of apoptosis in epithelial cells (anoikis) are still not well understood, the aim of this study was to identify proteins involved in anoikis. Proteins derived from human breast epithelial cell lines H184A1 and HBL-100 were separated by high resolution two-dimensional gel electrophoresis (2-DE). After silver-staining, more than 4000 protein spots could be visualized on a single 2-DE image of a size of 23 x 30 x 0.075 cm. The apoptotic 2-DE protein patterns have not revealed a complete degradation of cellular proteins confirming that apoptosis is a highly regulated process. Comparison of the 2-DE images of apoptotic and non-apoptotic cells by subtractive analysis showed that 31 protein spots were altered significantly in intensity after induction of apoptosis. These variant protein spots included 11 apoptose-associated proteins with their individual modifications: keratin 15, keratin 17, keratin 18, vimentin, lamin A, lamin C, desoxyuridine 5â-triphosphate nucleotidehydrolase (DUT-N), heat shock protein 27 kDa (HSP 27), myosin heavy chain, heteronuclear ribonucleoproteins C1 and C2 (hnRNP C1/C2) and cofilin. Disappearance of HSP 27 and cofilin spots after induction of apoptosis can presumedly be explained by a dephosphorylation of these proteins. The specific cleavage of keratin 15 (K15) and keratin 17 (K17) after induction of apoptosis was confirmed by Western blot analysis. Inhibition studies with the tetrapeptide inhibitor Z-DEVD-fmk revealed that the cleavage of K15 and K17 is a result of caspase-3 or caspase-3 like proteases. The exact caspase recognition sites could be determined in K15 and K17 by mass spectrometry. Furthermore, five caspase recognition sites could be determined in b-catenin, one in E-cadherin and one in human UV excision repair protein RAD23 homolog B (hHR23B).
Altogether, 109 proteins were identified in the H184A1 cell line by mass spectrometry (94% of the proteins by ESI-MS/MS) leading to a construction of an internet-based 2-DE database (URL: http://141.80.156.97/groups/fg-doerken/2DE_EPI/2-DE/index.html) facilitating the comparison with other 2-DE patterns of human breast epithelial cells.
Anti-IgM-mediated apoptosis in mitochondria was investigated by separation of all mitochondrial proteins of B cells by 2-DE. Only minor differences between apoptotic and non-apoptotic mitochondria could be observed. Two variant protein spots were present in amounts sufficient for an identification by mass spectrometry: pyruvate dehydrogenase E1 a and inosine-5'-monophosphate dehydrogenase 2.
A method was developed based on reversed phase liquid chromatography (RP-HPLC) which facilitates the enrichment of less-abundant proteins and the prefractionation of complex protein mixtures such as cell lysates prior to 2-DE. The crude cell lysates containing 9 M urea were loaded directly onto the column and the proteins were eluted in a five-step gradient with increasing concentrations of acetonitrile resulting in five 2-DE gels. The reproducibility of this method allows the comparison of 2-DE protein patterns of apoptotic and non-apoptotic cells. In principle, the rate of enrichment has no limits if several subsequent LC runs are pooled.
Das Wissen über das Proteom, die Gesamtheit aller vom Genom exprimierten Proteine, eröffnet den Zugang zu einer Vielzahl von Informationen über (i) ob und wann ein bestimmtes Genprodukt translatiert wird, (ii) die relative Konzentration von Genprodukten und (iii) das Ausmaß von posttranslationalen Modifikationen. Keiner dieser Informationen kann von der DNA alleine vorhergesagt werden. Im Rahmen dieser Arbeit sollte mit Hilfe der Proteomanalyse der zelluläre Prozess der Apoptose, auch programmierter Zelltod genannt, untersucht werden. Apoptose ist ein hochgeordneter Prozess mit charakteristischen morphologischen und biochemischen Veränderungen der Zelle. Der programmierte Zelltod spielt eine wichtige Rolle während der Embryonalentwicklung, Differenzierung und Metamorphose. Epitheliale Zellen sterben durch Apoptose, wenn sie ihren Zell-Zell oder Zell-Matrix Kontakt verlieren, diese Form des Zelltodes wird auch Anoikis genannt. Da der molekulare Mechanismus, welcher der Anoikis zugrunde liegt, noch unzureichend geklärt ist, sollte das Ziel dieser Arbeit sein, Proteine zu identifizieren, die am apoptotischen Prozess in Epithelzellen beteiligt sind. Dazu wurden die Proteine aus den humanen Brustzelllinien H184A1 und HBL-100 durch die hochauflösende zwei-dimensionale Gelelektrophorese (2-DE) aufgetrennt und die erhaltenen 2-DE Proteinmuster mit denen von apoptotischen Zellen verglichen. Apoptose wurde in diesen Zellen entweder durch Applikation von Staurosporin (ein Proteinkinaseinhibitor) ausgelöst oder dadurch, dass die Zellen gehindert wurden, Zell-Zell oder Zell-Matrix Kontakte auszubilden. Durch Silberfärbung konnten auf einem 2-DE Gel mit der Größe von 23 x 30 x 0.075 cm annährend 4000 Proteinspots gezählt werden. Obwohl die Apoptose von massiven morphologischen Anderungen der Zelle begleitet ist, zeigten die 2-DE Proteinmuster von Zellen 20 h nach Auslösung der Apoptose keinerlei Anzeichen für eine wahllose Degradation von Proteinen. Durch Vergleich der apoptotischen und der nicht-apoptotischen 2-DE Proteinmuster, der sogenannten subtraktiven Analyse, wurden zusammen 31 Proteinspots beobachtet, die eine signifikant unterschiedliche Intensität in beiden Zuständen aufwiesen. Diese Spots wurden mit massenspektrometrischen Techniken, hauptsächlich Elektrospray-Tandem-Massenspektrometrie (ESI-MS/MS), identifiziert. Diese varianten Proteinspots stammten von 11 apoptose-assoziierten Proteinen und ihren individuellen Modifikationen: Keratin 15, Keratin 17, Keratin 18, Vimentin, Lamin A, Lamin C, Desoxyuridin 5Ç-Triphosphat Nukleotidhydrolase-Nukleare Isoform (DUT-N), Hitzeschockprotein 27 kDa (HSP27), Myosin schwere Kette, heterogenes nukleares Ribonukleoprotein C1/C2 (hnRNP C1/C2) und Cofilin. Die Beteiligung von Keratin 18, Lamin A und C, Vimentin, DUT-N und hnRNP C1/C2 während der Apoptose konnte schon in früheren Untersuchungen gezeigt werden. Diese Proteine dienten daher als Positivkontrollen. Proteinspots von HSP27 und Cofilin verschwanden nach Auslösung der Apoptose, offensichtlich durch einen Dephosphorylierungsvorgang. Anhand der 2-DE Gele konnte gezeigt werden, dass Keratin 15 und 17 während der Apoptose gespalten werden. Durch Untersuchungen mit dem spezifischen Tetrapeptid-Inhibitor Z-DEVD-fmk konnte gezeigt werden, dass Caspase-3 oder Caspase-3 ähnliche Proteasen für die Spaltung verantwortlich sind. Die genauen Spaltstellen in Keratin 15 und Keratin 17 konnten durch ESI-MS/MS bestimmt werden: In Keratin 15 und Keratin 17 wurde eine Spaltstelle in der Linker L1-2 Region mit der Erkennungssequenz VEMD gefunden und in Keratin 17 eine weitere an der Position D416. Desweiteren konnten genaue Spaltstellen in b-Catenin und E-Cadherin gefunden werden. Beide Proteine sind an der Zell-Zell Adhäsion beteiligt und werden spezifisch während Anoikis gespalten. Darüberhinaus ist b-Catenin am Wnt-Signalweg beteiligt. Fünf Spaltstellen konnten in b-Catenin (D32, D83, D115, D751 und D764) und eine in E-Cadherin (D752) durch N-terminale Sequenzierung und Massenspektrometrie bestimmt werden. Im humanen UV Exzisions-Reparaturprotein Rad23 Homolog B (hHR23B) konnte ebenfalls an der Stelle D165 eine Spaltstelle bestimmt werden. Insgesamt wurden in der humanen Brustepithelzelllinie H184A1 109 Proteine identifiziert, 94% davon mit ESI-MS/MS und 6% mit MALDI-MS durch "peptide mass fingerprinting". Mit diesen Daten und Informationen wurde eine internet-basierende 2-DE Datenbank aufgebaut (URL: http://141.80.156.97/groups/fg-doerken/2DE_EPI/2-DE/index.html), die einen Vergleich mit 2-DE Proteinmustern von anderen Brustepithelzellen erlaubt. Ergänzend zu den Untersuchungen in Epithelzellen wurde ebenfalls die Apoptose in Mitochondrien, isoliert aus B-Zellen, untersucht. Nach anti-IgM induzierter Apoptose in der BL60 Zelllinie wurden die Mitochondrien isoliert und deren Proteine durch die 2-DE aufgetrennt und mit den entsprechenden Proteinmustern von nicht-apoptotischen Mitochondrien verglichen. Es wurden jedoch nur geringe Unterschiede zwischen beiden Zuständen beobachtet. Zwei variante Proteinspots konnten identifiziert werden: Pyrovat Dehydrogenase E1 a und Inosine 5Ç-Monophosphat Dehydrogenase 2. Ein großer Nachteil der zwei-dimensionalen Gelelektrophorese und damit der gesamten Proteomforschung ist, dass nur ein geringer Teil der zellulären Proteine auf einem 2-DE Gel sichtbar gemacht werden können. Der große Teil der Proteine liegt in der Zelle nur in geringer Konzentration vor, so dass er nicht mit herkömmlichen Methoden sichtbar ist, noch durch massenspektrometrische Methoden identifiziert werden kann. Daher wurde eine Methode entwickelt, Proteinproben, von Zelllysaten stammend, aufzutrennen, d.h. vorzufraktionieren und die Proteinmenge gleichzeitig anzureichern. Dazu wurde das gesamte Zelllysat auf eine Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) Säule geladen und die Proteine mit einem 5-Stufen-Gradienten wieder von der Säule eluiert, wobei in jedem Schritt die Acetonitril-Konzentration erhöht wurde. Proteine jeder Stufe wurden anschließend durch 2-DE getrennt, so dass aus einer Probe fünf 2-DE Gele resultierten. Durch mehrere HPLC Läufe nacheinander kann die Proteinmenge beliebig gesteigert werden. Die Reproduzierbarkeit der Methode ist ausreichend, um Proben von apoptotischen und nicht-apoptotischen Zellen zu vergleichen und unterschiedlich exprimierte Proteine identifizieren zu können.
| Betreuer | Wittmann-Liebold, Brigitte; Prof. Dr. |
| Gutachter | Salnikow, Johann; Prof. Dr. |
| Gutachter | Wittmann-Liebold, Brigitte; Prof. Dr. |
| Upload: | 2000-10-10 |
| URL of Theses: | http://edocs.tu-berlin.de/diss/2000/badock_volker.pdf |