| De novo synthesized proteins with metalloporphyrin cofactors |
Schlüsselwörter:
De-novo-Protein-Synthese, Kofaktor-Protein-Wechselwirkung, EPR-Spektroskopie, ENDOR-Spektroskopie, Hämproteine
protein de novo synthesis, cofactor protein interaction, EPR spectroscopy, ENDOR spectroscopy, heme proteins
Sachgruppe der DNBAbstract
Protein de novo synthesis offers the opportunity to
construct artificial protein models, which are of major interest to study
protein folding and function and for technical applications. In this work a
variety of de novo synthesized proteins with metalloporphyrin cofactors were
synthesized and investigated. The design of these polypeptide modules is based
on the structural motif of a four-helix bundle. Its simple but compact structure
is well suited to study protein-cofactor-interactions. Linear peptides, which
form amphiphilic helices in aqueous solution, were synthesized via solid phase
peptide synthesis. These helical building blocks were then fixed on a template
to obtain a four-helix bundle structure. In the hydrophobic core
metalloporphyrin cofactors were incorporated via axial ligation with histidine
side chains. Using different central metals (Fe 3+ (heme), Co 2+ and Zn 2+) a
variety of functional properties were introduced into the polypeptide modules.
It was shown, that the redox potential of the cofactor heme can be influenced by
the peptide environment. The incorporation of Zn(II)porphyrin into a four-helix
bundle was an important step towards artificial protein models for
photosynthesis. The light induced electron transfer of this four-helix-bundle to
quinone in solution was measured. Furthermore a characterization method based on
EPR and ENDOR spectroscopy was established, which leads to a detailled
discription of the cofactor binding in de novo synthesized heme proteins. The
spin state, the g-tensor values, the EPR linewidth and the hyperfine interaction
of the histidine protons were used as spectroscopic tools to characterize the
geometry of the axial heme ligation. Different de novo synthesized heme
proteins, which were modelled on the cytochrome b subunit of the cytochrome bc1
complex, were investigated with EPR and ENDOR spectroscopy. It was shown, that
the design concept of the four-helix bundle has a major influence on the
cofactor binding situation. The folding of the cofactor binding pocket is
different in template-associated synthetic proteins compared to four-helix
bundles, which are formed by the self-assembly of individual helical building
blocks.
Die Protein-de-novo-Synthese eröffnet vielfältige
Möglichkeiten zur Konstruktion künstlicher Proteinmodelle, die sowohl
hinsichtlich theoretischer Fragestellungen zur Faltung und Funktion natürlicher
Proteine als auch für technische Anwendungen von großem Interesse sind. In
dieser Arbeit wurden verschiedene de novo synthetisierte Proteine mit
Metalloporphyrinkofaktoren hergestellt und untersucht. Dem Design dieser
Polypeptidmodule liegt ein Vier-Helix-Bündel als Faltungsmotiv zu Grunde, dessen
einfache und kompakte Struktur gute Vorausetzungen zur Untersuchung der
Protein-Kofaktor-Wechselwirkung bietet. Zur Konstruktion der Polypeptidmodule
wurden einzelne lineare Peptide, die in wäßriger Lösung amphiphile Helices
ausbilden, mittels chemischer Festphasen-Peptid Synthese hergestellt und auf
einem Trägermolekül zu einem Vier-Helix-Bündel angeordnet. In den hydrophoben
Innenraum dieser Vier-Helix-Bündel konnten über Histidin-Seitengruppen
Metalloporphyrinkofaktoren eingebunden werden. Durch den Einsatz
unterschiedlicher Zentralmetallionen (Fe 3+ (Hämin), Co 3+ und Zn 2+ ) konnten
verschiedene funktionelle Eigenschaften in die Vier-Helix-Bündel eingeführt
werden. Dabei zeigte sich beispielsweise, daß das Redoxpotential des
Häminkofaktors durch die Peptidumgebung beeinflußt werden kann. Durch den Einbau
des Zink(II)porphyrins in ein Vier-Helix-Bündel wurde ein wichtiger Schritt zur
Entwicklung künstlicher Proteinmodelle für die Photosynthese realisiert. An
diesem System wurde der lichtinduzierte Elektronentransfer zu einem Chinon in
Lösung gemessen. Ferner wurde im Rahmen dieser Arbeit eine
Charakterisierungsmethode zur detaillierten Beschreibung der Kofaktoreinbindung
in de novo synthetisierten Hämproteinen auf der Basis der EPR- und
ENDOR-Spektroskopie ausgearbeitet. Der Spin-Zustand, die g-Tensorhauptwerte, die
EPR-Linienbreiten und die Hyperfeinwechselwirkung der Histidinprotonen wurden
als strukturelle Proben herangezogen, um die Geometrie der axialen Ligandierung
des Kofaktors zu bestimmen. Mit Hilfe der EPR- und ENDOR-Spektroskopie wurden
verschiedene de novo synthetisierte Hämproteine, die nach der Cytochrom b
Untereinheit des Cytochrom bc 1 Komplexes modelliert wurden, untersucht. Dabei
wurde festgestellt, daß das Designkonzept der Vier-Helix-Bündel die
Einbausituation des Kofaktors maßgeblich beeinflußt. Die Faltung der
Kofaktorbindungstasche in Templat-assoziierten synthetischen Proteinen
unterschied sich dabei von der Kofaktoreinbindung in Vier-Helix-Bündeln, die auf
der flexiblen Selbstassoziation einzelner helicaler Bausteine beruhen.
| Betreuer | Lubitz, Wolfgang; Prof. Dr. |
| Gutachter | Lubitz, Wolfgang; Prof. Dr. |
| Gutachter | Schlodder, Eberhardt; Priv.-Doz. Dr. |
| Upload: | 2000-08-28 |
| URL of Theses: | http://edocs.tu-berlin.de/diss/2000/fahnenschmidt_monika.pdf |