| Development of a two-dimensional, chromatographic system for the automated purification of proteins |
Schlüsselwörter:
Proteinreinigung, Flüssigkeitschromatographie, zweidimensional, Ionenaustausch, hydrophobe Interaktion
protein purification, liquid chromatography, two-dimensional, ion exchange, hydrophobic interaction
Sachgruppe der DNBAbstract
A protocol for the comprehensive, two-dimensional separation of complex mixtures of proteins under non-denaturing conditions has been developed which uses ion exchange chromatography (IEX) in the first dimension followed by hydrophobic interaction chromatography (HIC) in the second dimension. The protocol has been tested with a protein extract derived from Saccharomyces cerevisiae. Because of the underlying principles of separation it is expected that the protocol will be applicable to mixtures of proteins from a wide range of sources. In the first dimension of the two-dimensional separation the extract was applied to a cation exchanger coupled to an anion exchanger both of which were eluted separately. The optimum pH was found to be 6.6 at which 13 % of the proteins were eluted from the cation exchanger and 85 % from the anion exchanger. Peaks eluted from the first dimension were subjected to a two step hydrophobic interaction chromatography. Binding of the proteins was induced by raising the concentration of ammonium sulfate to 1.33 M prior to the first column and unbound proteins were trapped on a second column by raising the salt concentration to 2.25 M. By distributing proteins on two separate columns a preseparation was achieved on the basis of their various hydrophobicities. As in the first dimension further separation was achieved by gradient-elution of the two columns after they had been uncoupled. Protein recovery was about 67 % but loss of specific proteins due to precipitation at high salt concentrations during the second dimension separation could not be observed. The combination of gradient ion exchange in the first and hydrophobic interaction chromatography in the second dimension yielded a theoretical peak capacity of 152 which is comparable to other two-dimensional chromatographic systems. Using matrices with higher efficiencies peak capacities of up to 700 are realistic. The automated protocol in its current form is able to distribute the proteins of a complex mixture to 592 fractions within 3.5 h. This corresponds to a reduction of the complexity of the sample by a factor of about 70. The protein load used to determine the parameter of the separation was 25 mg which is markedly higher than in other comprehensive systems developed so far. A scaling up of the protocol is easily performed to allow an even higher protein load . This is especially important for the identification of low copy proteins in the mapping of proteomes. After separation this 2D-protocol returns proteins in solution and in their native form both of which are conducive to activity assays and further separations. The protocol described here is useful for a fast prefractionation of complex mixtures of proteins on a laboratory scale. It reduces the time-consuming and laborious development of purification strategies for the mainpart of separation problems. Sample preparation is reduced to the removal of contaminating substances and an exchange of sample buffer for running buffer.
Auf der Grundlage der Ionenaustausch- und der hydrophoben Interaktionschromatographie wurde ein Protokoll zur umfassenden, zweidimensionalen Auftrennung komplexer Proteingemische unter nativen Bedingungen entwickelt. Die Auslegung der Trennverfahren erfolgte unter Verwendung eines Extraktes aus Saccharomyces cerevisiae. Aufgrund der Trennprinzipien sollte das zweidimensionale, chromatographische System auch auf andere Extrakte anwendbar sein. In der ersten Dimension der zweidimensionalen Trennung wurde der Modellextrakt auf einen Kationen- und einen Anionenaustauscher aufgetragen, die bei der Beladung gekoppelt waren aber getrennt eluiert wurden. Bei einem optimalen pH-Wert des Laufpuffers von 6,6 wurden 13 % der Proteine vom Kationen- und 85 % vom Anionenaustauscher eluiert. Für die weitere Auftrennung der Fraktionen der ersten Dimension wurden in der zweiten Dimension zwei hydrophobe Interaktionssäulen eingesetzt. Die Bindung der Proteine erfolgte durch Anheben der Ammoniumsulfatkonzentration auf 1,33 M vor der ersten Säule. Ungebundene Proteine im Durchlauf wurden durch eine weitere Anhebung der Salzkonzentration auf 2,25 M auf einer zweiten Säule gebunden. Dadurch ergab sich bereits bei der Bindung auf eine der zwei Säulen eine Trennung der Proteine anhand ihrer unterschiedlichen hydrophoben Eigenschaften. Wie in der ersten Dimension wurde eine weitere Auftrennung durch die Gradientenelution der entkoppelten Säulen erzielt. Auch in der zweiten Dimension wurden die Säulen getrennt eluiert. Insgesamt wurden noch 67 % der aufgetragenen Proteine nach der Trennung nachgewiesen. Hinweise auf einen spezifischen Proteinverlust durch Präzipitation bei den Salzkonzentrationen der zweiten Dimension wurden nicht gefunden. Durch die Koppelung der Ionenaustauschchromatographie in der ersten und der hydrophoben Interaktionschromatographie in der zweiten Dimension wurde eine theoretische Peak-Kapazität von 152 erreicht. Diese entspricht in etwa den Kapazitäten anderer zweidimensionaler Chromatographien. Unter Verwendung leistungsfähigerer Matrizes in beiden Dimensionen ist eine Steigerung dieser Kapazität auf etwa 700 realistisch. In der vorliegenden Form würden die Proteine eines komplexen Gemisches, nach erfolgter Automatisierung des Systems, innerhalb von 3,5 h auf insgesamt 592 Fraktionen verteilt. Dies entspricht einer Reduzierung der Komplexität der Probe um den Faktor 70. Die Proteinbeladung des vorgeschlagenen Verfahrens liegt mit 25 mg pro Lauf deutlich über der Proteinkapazität bisher entwickelter Verfahren. Zusätzlich ist eine Maßstabsvergrößerung einfach durchführbar. Dies ist insbesondere für die Untersuchung und den Nachweis schwach exprimierter Proteine in der Proteomforschung von Bedeutung. Die Proteine liegen nach der Trennung gelöst und in der nativen Konformation vor. Damit stehen sie direkt für weitere Aufreinigungsschritte, Aktivitätstests oder Nachweismethoden zur Verfügung. Das Verfahren ist für eine schnelle Proteinaufreinigung im Labormaßstab geeignet und reduziert für einen Großteil der Trennprobleme die zeit- und arbeitsintensive Ermittlung der optimalen Trennparameter. Die Probenvorbereitung beschränkt sich auf die Entfernung störender Substanzen und den Austausch des Probenpuffers gegen den Laufpuffer.
| Betreuer | Stahl, Ulf; Prof. Dr.-Ing. |
| Gutachter | Stahl, Ulf; Prof. Dr.-Ing. |
| Gutachter | Thömmes, Jörg; PD Dr. rer. nat. |
| Gutachter | Frevert, Jürgen; Dr. rer. nat. |
| Upload: | 2000-05-18 |
| URL of Theses: | http://edocs.tu-berlin.de/diss/2000/peter_christoph.pdf |