FU Berlin Digitale Dissertation
Kai-Uwe Wolf : Die Einschleusung von humanem Rhinovirus Typ 14 (HRV-14) in HeLa-, BHK- und BHK-ICAM-1- Zellen The internalization of human rhinovirus typ 14 (HRV-14) in HeLa-, BHK- and BHK-ICAM-1- cells
|Zusammenfassung| |Inhaltsverzeichnis|

Zusammenfassung Es wurden die frühen Reproduktionsschritte vom Schnupfenvirus (Humanes Rhinovirus Typ 14, HRV-14) mit der Fragestellung untersucht, inwieweit der Virusrezeptor allein die Infektion von Zellen determiniert. Dazu wurden BHK-Zellen eingesetzt, die durch den fehlenden Virusrezeptor Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM 1) nicht in der Lage sind, mit HRV-14 infiziert zu werden. Als infizierbare Zellen dienten ICAM-1-tragende und für HRV-14 empfängliche HeLa-Zellen. Zur Klärung der Frage, ob der Virusrezeptor allein für eine Infektion einer Zelle verantwortlich ist, wurden nichtinfizierbare BHK-Zellen mit dem Virusrezeptor ICAM 1 transfiziert (BHK-ICAM 1-Zellen). Für HeLa-Zellen konnte gezeigt werden, dass HRV-14 über die Vermittlung von ICAM 1 als Virusrezeptor in ?clathrin coated? Vesikel aufgenommen wird, und es anschließend über einen pH-abhängigen Schritt zum Uncoating des Virus mit Freisetzung der viralen RNA für die nachfolgende Translation und Neusynthese viraler RNA kommt. Die Neusynthese reifer Rhinoviren wurde transmissionselektronenmikroskopisch und durch Bestimmung infektiöser Virusnachkommenschaft belegt. Anders verlief die HRV-14 Infektion bei BHK-ICAM 1-Zellen. Es war zwar eine transmissionselektronenmikroskopisch nachgewiesene, rezeptorvermittelte Virusaufnahme zu beobachten, jedoch konnte im weiteren Verlauf der Reproduktion weder eine Neu-synthese von viraler RNA und viralen Proteinen noch von reifen Rhinoviren nachgewiesen werden. Bei BHK-ICAM 1-Zellen wurde die Ausbildung intrazellulärer, lan-ger schlauchförmiger, virushaltiger Membransysteme beobachtet. ICAM 1 war als virusspezifischer Rezeptor auf BHK-ICAM 1-Zellen funktionell aktiv, wie durch eine produktive Infektion mit Coxsackievirus A21, das ebenfalls ICAM 1 als Virusrezeptor besitzt, gezeigt werden konnte. Die Ergebnisse erlauben den Schluss, dass in BHK-ICAM 1-Zellen eine Blockade im Reproduktionszyklus von HRV-14 vorliegt. Diese Blockade im Reproduktionszyklus erfolgt nach der Virusadsorption bei oder kurz nach dem Uncoating. Es bleibt zu klä-ren, ob die Blockade auf der Ebene der Initiation der viralen Translation oder viralen Transkription liegt.

Inhaltsverzeichnis Die gesamte Dissertation können Sie als gezippten tar-File oder als zip-File laden. Durch Anklicken der Kapitelüberschriften können Sie das Kapitel in PDF-Format laden: 0. Titelblatt und Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 1 1.1. Die Familie der Picornaviren 1 1.1.1 Das Humane Rhinovirus Typ 14 (HRV-14) 6 1.1.2 Die Virusstruktur von HRV-14 6 1.2. Virusrezeptoren 9 1.2.1. ICAM 1 als Virusrezeptor für HRV-14 12 1.3. Der Reproduktionsmechanismus von Picornaviren 16 1.4. Zielsetzung 22 2. Material und Methoden 23 2.1. Abkürzungen 23 2.2. Verwendete Medien 25 2.3. Verwendete Lösungen, Puffer und Seren 27 2.1. Eingesetzte Substanzen 14 2.4. Zellen 31 2.4.1. HeLa-Zellen 31 2.4.2. BHK-Zellen 31 2.4.3. BHK-ICAM-1-Zellen 31 2.4.3.1. Transfektion von BHK-Zellen mit ICAM 1 32 2.5. Propagierung von HRV-14 und Coxsackievirus A21 33 2.6. Hochreinigung von HRV-14 34 2.7. RNA-Synthese-Test 35 2.7.1. RNA-Synthese-Inhibitions-Test 37 2.8. Plaque-Test 38 2.8.1. Plaque-Reduktions-Test 39 2.9. Endpunktstitration 40 2.10. Elektronenmikroskopie 41 2.11. ELISA zum Nachweis von membranständigem ICAM 1 (ICAM 1-ELISA) 42 2.12. ELISA zum Nachweis von zellgebundenem HRV-14 (HRV 14-ELISA) 43 2.13. Gradientenzentrifugation 45 2.14. Die Markierung viraler Proteine mit 35S-Methionin 46 2.15. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 47 3. Ergebnisse 49 3.1. Die Einschleusung von HRV-14 in HeLa-Zellen durch rezeptorvermittelte Endozytose 49 3.1.1. Viruseinschleusung und morphologische Veränderungen in HeLa-Zellen im Elektronenmikroskop nach Infektion mit HRV-14 49 3.1.2. Die Beteiligung von ICAM 1 an der Einschleusung in HeLa-Zellen 51 3.1.2.1. Die Blockierung der Adsorption von HRV-14 mit Anti-ICAM 1 52 3.1.2.2. Die Kompetition der Adsorption von HRV-14 mit löslichem ICAM 1:Ig 54 3.1.2.3. Das pH-abhängige Uncoating von HRV-14 59 3.2. Die Einschleusung von HRV-14 in BHK-ICAM 1-Zellen 61 3.2.1. Der Nachweis von ICAM 1 auf BHK-ICAM 1-Zellen 1-Zellen 62 3.2.2. Viruseinschleusung und morphologische Veränderungen in BHK-ICAM 1-Zellen im Elektronenmikroskop im Vergleich zu BHK-Zellen nach Infektion mit HRV-14 63 3.2.3. Die Beteiligung von ICAM 1 an der Einschleusung von HRV-14 in BHK-ICAM 1-Zellen 66 3.2.3.1. Der Nachweis der Bindung von HRV-14 an BHK-ICAM 1-Zellen 66 3.2.3.2. Die Bestimmung der RNA-Synthese von HRV-14 in BHK-ICAM 1-Zellen 68 3.2.3.3. Die Bestimmung von infektiöser Virusnachkommenschaft von HRV 14 in BHK-ICAM 1-Zellen 69 3.2.3.4. Die Bestimmung von infektiöser Virusnachkommenschaft von HRV 14 im Vergleich zu Coxsackievirus A21 in BHK-ICAM 1-Zellen 71 3.2.3.5. Die Bestimmung von HRV-14-Proteinen in BHK-ICAM 1-Zellen im Vergleich zu HeLa- und BHK-Zellen 74 4. Diskussion 78 4.1. Verlauf der frühen Reproduktionsschritte von HRV-14 in HeLa-Zellen 78 4.2. Einfluss von ICAM 1 als Virusrezeptor von HRV-14 auf die Adsorption und Penetration von HRV-14 in transfizierte BHK-ICAM 1-Zellen 79 4.3. Einfluss von virusbindenden Rezeptoren auf die Permissivität von transfizierten Zellen 81 4.4. Ablauf der frühen Reproduktionsschritte am Beispiel von Picornaviren, Semliki Forest Virus und Influenzaviren 83 4.4.1. Wechselwirkung des Virus mit dem Virusrezeptor und Aufnahme des Virus in die Zelle 83 4.4.2. Uncoating und Freisetzung der viralen RNA 85 4.4.3. Initiation der Translation zu Beginn des ersten Replikationszyklusses 88 4.5. Mögliche Ursachen des Effekts von zellgebundenem ICAM 1 auf die Aufnahme von HRV-14 in BHK-ICAM 1-Zellen im Unterschied zu HeLa-Zellen 93 5. Zusammenfassung 96 6. Literatur 97