Steffen Kießig

Untersuchung von Protein-Ligand-Interaktionen mit Affinitätskapillarelektrophorese

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 11.04.2002

Abstract
Die Untersuchung von Bindungsereignissen zwischen Proteinen und Liganden ist ein wichtiges Arbeitsgebiet der Biochemie. Solche Interaktionen sind in allen Bereichen der modernen biochemischen Forschung von besonderem Interesse. So sind Protein-Ligand-Wechselwirkungen wichtige Prozesse im Rahmen von Signaltransduktion, Proteinsynthese und -faltung sowie der Immunreaktion.
Unter den etablierten Methoden zur Interaktionsanalyse haben elektrophoretische Verfahren als Methoden der klassischen biochemischen Analyse eine vielfältige Bedeutung. In der letzten Zeit hat die Kapillarelektrophorese (CE) als Weiterentwicklung von Flachbettelektrophorese-Methoden an Interesse gewonnen. Neben der hohen Trennleistung zeichnet sich die CE auf Grund der großen Variabilität der Trennbedingungen durch eine hervorragende Adaptierbarkeit an vielfältige Analysenprobleme aus. Die Affinitätskapillarelektrophorese (ACE) wurde als Methode zur Interaktionsanalyse bei minimiertem Materialaufwand entwickelt.
In der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen von Protein-Ligand-Interaktionen an Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerasen (PPIasen), einer Enzymklasse, die die cis/trans-Isomerisierung an Peptidyl-Prolyl-Bindungen in Peptiden und Proteinen katalysiert, durchgeführt. Für die Untersuchungen wurden verschiedene Liganden unterschiedlicher Affinität eingesetzt. Am Beispiel der PPIase Cyclophilin 18 konnte der Einsatz der ACE zur quantitativen Charakterisierung von Interaktionen mit Peptid-Liganden hoher und geringer Affinität demonstriert werden. Die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen durch ACE erfolgte im Rahmen der Bindung von Cyclophilin an das Capsidprotein p24 des human immunodeficiency virus 1. In einem letzten Teil konnte die ACE erfolgreich zur Charakterisierung unbekannter Wechselwirkungen an Cellulose-gebundenen ortsaufgelösten Oligopeptidbibliotheken und in Zell-Lysaten eingesetzt werden.

The analysis of protein-ligand binding is an important part of biochemical research. These interactions influence almost all fields of interest of modern biochemistry. Protein-ligand interactions are important processes of signal transduction, synthesis and folding of proteins as well as immune reactions.
Classical analysis by electrophoresis is of special interest among the established methods for the investigation of interactions. In recent years the interest was focused on capillary electrophoresis (CE) a method developed from common electrophoresis. CE is characterized by high separation power and adaptability to a broad range of analytical problems. Affinity capillary electrophoresis (ACE) was developed for the analysis of interactions with minimal consumption of material.
In the present work protein-ligand interactions were analyzed with respect to peptidyl-prolyl-cis/trans-isomerases (PPIases). PPIases are a class of enzymes that catalyze the cis/trans isomerization of peptidyl-prolyl-bonds in peptides and proteins. Ligands of different affinity were applied. ACE was utilized for the quantitative analysis of Cyclophilin 18 interactions with high and low affinity peptide ligands. The analysis of protein-protein-interactions using ACE was performed for the binding of Cyclophilin to the capsid protein p24 of the human immunodeficiency virus 1. In the final chapter ACE was successfully applied to screen for unknown interactions exemplified by cellulose-bound peptide libraries and cell lysates.

Keywords:
Affinitätskapillarelektrophorese, ACE, Interaktionsanalyse, Cyclophilin, Cyclosporin, Grün-fluoreszierendes Protein, Protein-Protein-Interaktion

Affinity capillary electrophoresis, ACE, analysis of interactions, cyclophilin, cyclosporin, green fluorescent protein, protein-protein interaction

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Inhaltsverzeichnis
Inhalt
1 Einleitung (4-23)
2 Kapillarelektrophorese - Theoretischer Teil (24-32)
3 Material und Methoden (33-53)
4 Ergebnisse (54-84)
5 Diskussion (85-100)
6 Zusammenfassung (101-103)
7 Literaturverzeichnis (104-115)
8 Abkürzungen und Symbole (116-119)
Thesen zur Dissertation