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FU Berlin
Digitale Dissertation

Gerit Goltz :
Charakterisierung von Ceramidase-Inhibitoren an der humanen Keratinozyten-Zellinie HaCaT
Characterization of ceramidase inhibitors in the human keratinocyte cell line HaCaT

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|Zusammenfassung| |Inhaltsverzeichnis| |Ergänzende Angaben|

Zusammenfassung

In der vorliegenden Arbeit wurden die Phenylaminoalkohol-Derivate D-erythro-2-(N-Myristoylamino)-1-phenyl-1-propanol (D-e-MAPP), L-erythro-2-(N-Myristoylamino)-1-phenyl-1-propanol (L-e-MAPP) und das neu synthetisierte Analogon D-threo-2-(N-Myristoylamino)-1-(4-nitrophenyl)-1,3-propandiol (D-NMAPPD bzw. B13) im Hinblick auf ihre biologischen und biochemischen Wirkungen in HaCaT-Keratinozyten untersucht. Kuerzlichen Veroeffentlichungen zufolge fuehrte D-e-MAPP in HL-60 Zellen durch Inhibition der alkalischen Ceramidase zu intrazellulaerem Ceramid-Anstieg und nachfolgender Zellwachstumshemmung. Wir hingegen konnten fuer HaCaT-Keratinozyten zeigen, dass D-e-MAPP und B13 die saure Ceramidase inhibieren, wobei B13 den staerksten Inhibitor darstellt und L-e-MAPP keinen signifikanten Effekt hat. Die alkalische Ceramidase wurde durch keines der drei Derivate beeinflusst. Es konnte ein Anstieg des intrazellulaeren Ceramid-Gehalts in direkter Proportionalitaet zum Grad der Ceramidase-Inhibition gemessen werden, gefolgt durch zeit- und konzentrationsabhaengige Apoptose und Proliferationshemmung der Zellen, wie dies auch fuer die Behandlung mit exogen gegebenen Ceramiden beschrieben wurde. Die Apoptose-Induktion durch B13 konnte durch Bcl-2-Ueberexpression der Zellen nahezu vollstaendig antagonisiert werden, implizierend, dass das durch saure Ceramidase-Inhibition generierte Ceramid seine Wirkung ueber mitochondriale Cytochrom c-Freisetzung mit nachfolgender Caspasen-Aktivierung und Apoptose enfaltet. Apoptose-Induktion und Proliferationshemmung waren, aehnlich den biochemischen Effekten, bei B13 am staerksten zu verzeichnen. Eine gewisse Stereospezifitaet -nur die D-Stereoisomere, nicht das L-Stereoisomer fuehrte zu den beobachteten Effekten- koennte neben anderen strukturellen Besonderheiten (1-Hydroxyl-Gruppe von B13 an einer dem Ceramid gleichen Position) wichtig fuer die Substraterkennung bzw. Bindungsfaehigkeit der Ceramidase sein und somit die biologische Funktionalitaet beeinflussen. Wir konnten in HaCaT-Keratinozyten demonstrieren, dass sich der endogene Ceramid-Spiegel durch Beeinflussung der sauren Ceramidase modulieren laesst und von wichtigen biologischen Konsequenzen begleitet wird. Dies hebt die saure Ceramidase neben ihrer Funktion des lysosomalen Abbaus von Sphingolipiden als eines der Schluessel-Enzyme des Ceramid-Stoffwechsels und somit zellulaerer Signaltransduktionsmechanismen hervor. Die untersuchten Ceramidase-Inhibitoren koennten eine neue Substanzklasse fuer die Therapie von sowohl benignen hyperproliferativen Hautkrankheiten, wie der Psoriasis vulgaris, als auch von malignen Hautkrankheiten, z.B. des Basalzell- oder Plattenepithelkarzinoms darstellen.

Inhaltsverzeichnis

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0. Titelblatt und Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 1
     
1.1 Struktur und Biosynthese von Ceramid 1
1.2 Der Sphingomyelinzyklus 2
1.3 Biologische Rolle von Ceramid 4
1.3.1 Ceramid und Apoptose 4
1.3.2 Haut und Apoptose 9
1.3.3 Rolle von Ceramid in der Haut 10
1.4 Ceramid-vermittelte Signalwege 11
1.5 Modulation intrazellulärer Ceramid-Spiegel 14
1.5.1 Erhoehung des Ceramid-Spiegels 14
1.5.2 Verminderung des Ceramid-Spiegels 16
1.6 Ceramidasen 18
1.6.1 Vorkommen und Isoformen der Ceramidase 18
1.6.2 Ceramidase-Inhibitoren 21
1.7 Fragestellung der Arbeit 22
     
2. Material 24
     
2.1 Geraete 24
2.2 Zellinien 25
2.3 Phenylaminoalkohol-Derivate 25
2.4 Radioaktivität 26
2.5 PCR-Reagenzien 26
2.6 Chemikalien 27
2.7 Zellkulturmaterialien 27
     
3. Methoden 29
     
3.1 Zellkultur 29
3.1.1 Zellkulturmedien 29
3.1.2 Kultivierung der Zellen 30
3.1.3 Einfrieren und Auftauen der Zellen 30
3.2 Behandlung der Zellen mit den Phenylaminoalkohol-Derivaten 31
3.3 Messung der Zytotoxizität 31
3.4 Messung der Apoptose 33
3.5 Messung der Proliferation 35
3.6 Proteinbestimmung mit Bicinchoninsäure 37
3.7 Lipidchemische Methoden 39
3.7.1 Lipid-Extraktion 39
3.7.2 Duennschichtchromatographische Trennung von Lipiden 40
3.7.3 Nachweis radioaktiv-markierter Lipide 40
3.7.4 Nachweis nichtradioaktiver Lipide 41
3.8 Bestimmung der Ceramidase-Enzymaktivität 41
3.9 Messung des Ceramid-Gehaltes 44
3.10 Polymerase-Kettenreaktion 45
3.11 Statistische Auswertung der Ergebnisse 48
     
4. Ergebnisse 49
     
4.1 Bestimmung der Zytotoxizität der Phenylaminoalkohol-Derivate L-e-MAPP, D-e-MAPP und B13 auf HaCaT-Keratinozyten 49
4.2 Apoptotischer Effekt der Phenylaminoalkohol-Derivate L-e-MAPP, D-e-MAPP und B13 auf HaCaT-Keratinozyten 52
4.3 Einfluß von bcl-2 auf die Phenylaminoalkohol-induzierte Apoptose 55
4.4 Beeinflussung des Wachstumsverhaltens von HaCaT-Keratinozyten durch die Phenylaminoalkohol-Derivate L-e-MAPP, D-e-MAPP und B13 56
4.5 Darstellung der sauren Ceramidase-Isoform in HaCaT-Keratinozyten mittels RT-PCR 59
4.6 Effekte der Phenylaminoalkohol-Derivate auf die Ceramidase-Isoformen in HaCaT-Keratinozyten 60
4.7 Beeinflussung des intrazellulären Ceramid-Spiegels durch die Phenylaminoalkohol-Derivate L-e-MAPP, D-e-MAPP und B13 63
     
5. Diskussion 65
     
6. Zusammenfassung 76
     
7. Literaturverzeichnis 78
     
8. Veroeffentlichungen 91
     
Danksagung I
     
Lebenslauf II

Ergänzende Angaben:

Online-Adresse: http://www.diss.fu-berlin.de/2002/180/index.html
Sprache: Deutsch
Keywords: apoptosis, ceramidase, b13, d-e-mapp, bcl-2
DNB-Sachgruppe: 33 Medizin
Datum der Disputation: 09-Jul-2002
Entstanden am: Fachbereich Humanmedizin, Freie Universität Berlin
Erster Gutachter: Prof. Dr. Dr. Christoph C. Geilen
Zweiter Gutachter: Prof. Dr. Werner Reutter
Kontakt (Verfasser): geritgoltz2002@yahoo.com
Kontakt (Betreuer): ccgeilen@zedat.fu-berlin.de
Abgabedatum:04-Sep-2002
Freigabedatum:10-Sep-2002

 

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