Two-Hybrid Studien mit N-
und C-terminal verkürztem Pex13p zeigten, dass bereits die ersten 55
Aminosäuren von Pex13p eine Interaktion mit dem PTS2-Erkennungsrezeptor Pex7p
eingehen. Diese Interaktion konnte in vivo durch eine Co-Immunopräzipitation
gezeigt werden. Dass es sich hierbei um eine direkte Interaktion handelt, wurde
in einer in vitro Bindungsstudie durch die Bindung zwischen GST-Pex13p1-100
und His6-Pex7p belegt.
Pex13p1-100 war
in der Lage, sowohl mit Pex18p als auch mit Pex21p zu interagieren. Die
Interaktion war hierbei von der Anwesenheit von Pex7p abhängig, wie in einer
Two-Hybrid Studie gezeigt werden konnte.
Ein aminoterminal
deletiertes Pex13p-Konstrukt (Pex13p56-386) war nicht in der Lage,
eine pex13D Mutante zu komplementieren. Somit hat dieser
aminoterminale Bereich für die Biogenese des Organells eine entscheidene
Funktion inne. Es konnte weiterhin durch Fluoreszenzstudien gezeigt werden,
dass dieser Bereich spezifisch für den PTS2-abhängigen Import benötigt wird. Da
die PTS1-Signalerkennung über die SH3-Domäne von Pex13p erfolgt, sind zwei
unterschiedliche Regionen in Pex13p an der PTS-Rezeptor-Erkennung beteiligt.
ß-Keto-Acyl-CoA-Thiolase
(Fox3p) interagierte mit dem peroxisomalen Dockingprotein Pex14p, jedoch nur in
Anwesenheit von Pex18p, Pex21p und von Pex7p. Andererseits konnte eine Bindung
an Pex13p nicht gezeigt werden, was bedeuten könnte, dass Pex14p beim Import
von PTS2-haltigen Proteinen das initiale Dockingprotein darstellt. Das Andocken
der PTS2-Cargoproteine erfolgte dabei offensichtlich sowohl in Abhängigkeit von
Pex7p als auch von Pex18p/Pex21p.
Die Menge an mit Pex7p
co-immunopräzipitiertem Fox3p war in einer pex18Dpex21D sowie in einer pex14Dpex18Dpex21D Mutante deutlich geringer
als in einer pex14D Mutante. Daraus wurde
geschlossen, dass die Anwesenheit von Pex18p und Pex21p bereits vor dem
Andocken von Pex7p an die peroxisomale Membran gebraucht wird. Die Funktion der
beiden cytosolisch lokalisierten, redundanten Proteine Pex18p und Pex21p liegt
wahrscheinlich in der Bildung eines importkompetenten PTS2-Substrat-Komplexes.
In einer in vitro
Bindungsstudie mit heterolog exprimiertem His6-Pex14p und MBP-Pex7p
konnte gezeigt werden, dass die Bindung zwischen Pex7p und Pex14p unabhängig
von der Anwesenheit von Pex18p/Pex21p stattfinden kann und somit direkt ist.
Durch eine in vitro
Bindungsstudie mit einem synthetischen PTS2-Protein gelang es zu zeigen, dass
Pex7p direkt an das PTS2-Signal binden kann.
Mit der Methode des
Two-Hybrid Systems konnte in Pex13p eine zweite Bindestelle für Pex14p
identifiziert werden. Der Bindebereich umfasst die Aminosäuren 233-258 von
Pex13p. Im Gegensatz zur SH3-Domäne erfolgt diese Bindung unabhängig von dem
prolinreichen Motiv von Pex14p.
Durch heterologe Expression
von Pex19p und seine Verwendung als Antigen konnte ein Antiserum gegen das
Protein gewonnen und dessen Spezifität gezeigt werden.
In einer Two-Hybrid Studie
konnte die Interaktion zwischen Pex19p und Pex13p gezeigt werden.
Der Aminosäurebereich 173-258 von Pex13p war ausreichend, um die Bindung in
vivo zu vermitteln. Mit einem Peptidscan gelang es außerdem, den
notwendigen Bindebereich für Pex19p auf die Aminosäuren 203-213 von Pex13p
einzuengen.
Auf der Suche nach einem
möglichen allgemeinen Targetingsignal für Membranproteine wurde der über einen
Peptidscan ermittelte Pex19p-Bindebereich 203-IMKFLKKILYR-213 umfassend
substituiert. Die beiden Leucine in Position 207 und 211 erwiesen sich hierbei
als entscheidend, womit sie vermutlich eine besondere Rolle bei der Bindung an
Pex19p einnehmen.
Es wurde ein Modell
erstellt, welches den möglichen Ablauf des PTS2-abhängigen Proteinimports
bechreibt (Abb. 4.1).
