Zusammenfassung
Die
vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Anwendung und Weiterentwicklung
von hochauflösenden NMR Methoden zur Proteinstrukturbestimmung. Im ersten Teil
wurden Methoden zur Berechnung von Sequenzen gepulster Feldgradienten für die Signalselektion,
sowie der Einfluß der Diffusion auf die Signalamplituden diskutiert, im zweiten
die Strukturbestimmung der Retinalumgebung des integralen Membranproteins
Baketeriorhodopsin auf der Basis einer neuen Markierungsstrategie.
Gepulste
Feldgradienten sind als Mittel zur Signalselektion und Artefaktunterdrückung
aus der modernen hochauflösenden NMR Spektroskopie nicht mehr wegzudenken. Im
Rahmen dieser Arbeit wurden die Computerprogramme TRIPLE GRADIENT und Z
GRADIENT zur Berechnung von optimierten Sequenzen gepulster Feldgradienten für
beliebige Experimente entwickelt und erprobt. Signalselektion auch unter
Berücksichtigung imperfekter RF-Pulse wurde exemplarisch am HSQC Experiment
gezeigt. Der den Programmen zugrunde liegende theoretische Formalismus wurde
erweitert, um erstmals sowohl stochastische als auch deterministische
translatorische Bewegungen der Teilchen zu berücksichtigen. Als quantitatives
Beispiel wurde der Einfluss freier Diffusion der Moleküle im HQQC Experiment
diskutiert. In diesem Zusammenhang wurde gezeigt, daß die Diffusionkonstante
von Ethanol korrekt aus der Analyse der Linienbreiten in der indirekten
Dimension bestimmt werden kann.
Das integrale Membranprotein
Bakteriorhodopsin wurde in Dodecylmaltosid Mizellen solubilisiert. An
vollständig deuterierten Proben mit einzelnen protonierten Resten des
Protein-Detergenz-Komplex mit einem Molekülgewicht von mehr als 60 kDa wurden 1H
NOESY Spektren aufgenommen und sequenzspezifische Signalzuordnungen erzielt.
Strukturen beider Formen des Proteins im dunkel-adaptierten Grundzustand wurden
mit Hilfe von Abständen zwischen Protonen in der Retinalbindungstasche
bestimmt. Die theoretische Analyse der chemischen Verschiebungen und der
Vergleich der all-trans/15-anti NMR Struktur mit Kristallstrukturen belegte die
hohe Genauigkeit dieser Methode der NMR Strukturbestimmung.
In der erstmals bestimmten
13-cis/15-syn Struktur ist der Abstand zwischen protonierter Schiff'scher Base
und ihrem komplexen Gegenion kürzer im Vergleich zur all-trans/15-anti
Struktur. Die relative Position der Retinalkohlenstoffe zu benachbarten
Tryptophanseitenketten ist fast identisch mit der Kristallstruktur eines frühen
Intermediaten des Photozyklus, bei der das Retinal in 13-cis/15-anti
Konfiguration vorliegt.
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