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Titelblatt, Inhaltsverzeichnis
1 Abkürzungen 6
2 Einleitung 7
2.1 Allgemeines 7
2.2 Klassifikation der Non-Hodgkin-Lymphome 8
2.3 Der T-Zell-Rezeptor: Aufbau und Funktion 10
2.4 Konfiguration der T-Zell-Rezeptor Gene in lymphatischen Zellen
11
2.5 Analyse der T-Zell-Rezeptor Gene mittels Polymerase-Kettenreaktion
15
2.6 Fragestellung und Ziele der Arbeit 17
3 Material und Methoden 18
3.1 Bezugsquellen für die verwendeten Geräte 18
3.2 Bezugsquellen für die verwendeten Chemikalien und Verbrauchsmaterial
19
3.3 Kontrollgewebe 19
3.4 Maligne Lymphome der T-Zellreihe 19
3.5 Histologie und Immunhistologie 20
3.6 DNA-Extraktion 21
3.6.1 Automatische DANN-Isolierung aus Patientenmaterial 21
3.6.2 DNA-Extraktion aus Paraffin-eingebettetem Gewebe 22
3.6.3 Isolierung mononukleärer Zellen (Ficoll-Gradient) 22
3.7 Bestimmung der DANN-Konzentration 22
3.8 Entwicklung einer PCR-Methode zum Nachweis von Umlagerungen der
TCR-ß-Kette 23
3.8.1 Kriterien für die Primerauswahl 23
3.8.2 Primersynthese 23
3.8.3 Aufreinigung der Oligonukleotide mittels HPLC 24
3.8.4 Optimierung der PCR-Bedingungen 24
3.8.5 Kontrollexperimente 24
3.9 Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) 25
3.9.1 Herstellung eines Polyacrylamidgels 26
3.9.2 Photodokumentation 26
3.10 Sequenzanalyse der Amplifikate 26
3.10.1 Sequenzreaktion 27
3.10.2 Auswertung der Sequenzen 29
3.11 Analyse von PCR-Produkten (GENESCAN-Analyse) 29
3.11.1 Vorbereitung der Gelelektrophorese 30
3.11.2 Probenvorbereitung für die Elektrophorese 31
3.11.3 Größenbestimmung von DNA-Fragmenten 32
4 Ergebnisse 33
4.1 Methodische Entwicklung 33
4.1.1 Etablierung einer TCR-ß PCR mittels hochdegenerierter Jß-Konsensusprimer
33
4.1.2 Eigene Entwicklung einer familienspezifischen TCR-ß PCR
35
4.1.3 Primerselektion für die Jß-Segmente 35
4.1.4 Primerselektion für die Vb-Segmente 36
4.1.5 Etablierung der Reaktionsbedingungen 38
4.1.6 Etablierung der GENESCAN-Analyse 40
4.1.7 Spezifität der familienspezifischen TCR-b PCR 41
4.1.8 Sensitivität der familienspezifischen TCR-b PCR 43
4.1.9 Sequenzanalyse von TCR-ß PCR-Produktion 44
4.1.10 Optimierung einer TCR-y PCR 46
4.1.11 Spezifität der TCR-g PCR 46
4.1.12 Sensitivität der TCR-g PCR 48
4.2 Untersuchung von Patientenmaterial 49
4.2.1 Molekularbiologische Verlaufsuntersuchung von CTCL-Patienten
mittels TCR-ß PCR im Vergleich zur TCR-y PCR 49
4.2.2 TCR-ß Analyse transformierter kutaner T-Zell-Lymphome 54
4.2.3 Klonalitätsanalysen von nicht-kutanen T-NHL mittels TCR-ß
PCR im Vergleich zur TCR-y PCR 58
4.2.4 Untersuchung von reaktiven Hautveränderungen mittels TCR-ß
und TCR-y PCR 62
4.2.5 Zusammenfassender Vergleich der familienspezifischen TCR-ß
PCR mit der TCR-y PCR 64
5 Diskussion 65
5.1 Methodische Aspekte 66
5.1.1 Vergleich bisher publizierter TCR-b PCRs 66
5.1.2 Vergleich mit der familienspezifischen TCR-b PCR 68
5.1.3 Vergleich der familienspezifischen TCR-b PCR mit TCR-y PCRs 69
5.1.4 Klonalitätsanalyse mittels GENESCAN-Technik 70
5.2 Klinische Aspekte 71
5.2.1 Untersuchung von normalem und reaktivem Gewebe 71
5.2.2 Maligne T-Zellproliferationen 71
5.2.3 Vorläuer-T-lymphoblastische Lymphome/Leukämien 72
5.2.4 Peripheres T-Zell-Lymphom, unspezifiziert 72
5.2.5 Kutane T-Zell-Lymphome 73
5.2.6 Anaplastisch großzellige Lymphome 76
5.2.7 Angioimmunoblastische T-Zell-Lymphome 77
5.2.8 Enteropathieassozierte T-Zell-Lymphome 78
5.2.9 Nasale T/NK-Zell-Lymphome 79
5.2.10 Morbus Hodgkin 79
6 Zusammenfassung 81
7 Literaturverzeichnis 82
8 Anhang 84
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