FU Berlin Digitale Dissertation
Marco K. Vallazza : Wege zum Thermus flavus 5S rRNA Kristall Moleküldesign, RNA-Komplexierung und strukturelle Fragmente Ways to the Thermus flavus 5S rRNA crystal
|Zusammenfassung| |Inhaltsverzeichnis| |Ergänzende Angaben|

Zusammenfassung Strukturell determinierte Funktionen von RNA-Molekülen lassen sich durch hochaufgelöste Kristallstrukturen erklären. Am Beispiel der Thermus flavus 5S rRNA - einem Gerüstmolekül der Peptidyltransferase - wurden im Rahmen dieser Arbeit drei Wege auf ihre Eignung untersucht, die RNA-Kristallisation zu verbessern: das Moleküldesign (1), die RNA-Komplexierung mit dem Protein TflL18 (2) und die 5S rRNA-Fragmentierung in strukturelle Domänen (3). Die Arbeit schloß gleichermaßen die Optimierung der Synthese und Aufrei­ni­gung der RNA- bzw. Protein­komponenten ein. Die Anpassung diverser Parameter der in-vitro Transkription resultierte in max. 1350 Kopien der rRNA vom Template. Durch die 3'-Prozessierung des heterogenen Transkript-Pools in der RNase-haltigen E. coli S100-Fraktion oder mittels eines optimierten DNA-Enzyms vom Typ 10-23 konnte ein homogenes RNA-Produkt erhalten werden. Zur Erklärung des Auftretens homogener Transkripte in-vitro wurde eine 5S rRNA-spezifische Verdrängungshypothese entwickelt. Kristallisationsstudien führten zu der Erkenntnis, daß das Kristallisationsfenster der engineerten Moleküle im Vergleich zum 5S rRNA Wildtyp nicht zu optimieren ist. Zwei ribosomale 5S rRNA-Bindungsproteine aus Th. flavus, bezeichnet mit TflL18 und TflL25, wurden kloniert und charakterisiert. Die beobachtete Sequenzvariabilität verschiedener L18-Spezies im mittleren Proteinbereich bewirkt mit hoher Wahrscheinlichkeit eine thermostabilisierende 3D-Faltung. Der Vergleich der Überexpression von TflL18 in E. coli und im Proteinbioreaktor ergab eine mindestens 20-fache Syntheserate des in-vitro Systems. Die native 5S rRNA Domäne B war für die Bindung von TflL18 essentiell. Ein Komplexkristall ansprechender Morphologie aus dem 5S rRNA Wildtyp und TflL18 konnte gezüchtet werden. Im Ergebnis systematischer Optimierungen der chemischen und physikalischen Parameter im Kristallisationsansatz wurden eine Diffusionskinetik für den Hängenden Tropfen sowie effektive Pufferkompositionen für die RNA-Kristallisation abgeleitet. Der positive Einfluß der Mikrogravitation auf das Kristallwachstum und das Diffraktionsverhalten ließ sich bestätigen. Sequenzvariable und schweratom-modifizierte Fragmente der Th. flavus 5S rRNA Domänen B, C und E konnten erfolgreich kristallisiert und mit Auflösungen von max. 1,5 Å vermessen werden. Die Strukturlösung der 8 bp Helix der Domäne E zeigte die Bedeutung konservierter struktureller Wassermoleküle für die Stabilisierung von G:U-Wobble-Basenpaaren und führte zur Entdeckung eines neuartigen G:C-Basenpaares in nicht-Watson-Crick-Formation, die durch eine Protonierung des Cytosins hervorgerufen wird.

Inhaltsverzeichnis Die gesamte Dissertation können Sie als gezippten tar-File oder als zip-File laden. Durch Anklicken der Kapitelüberschriften können Sie das Kapitel in PDF-Format laden: Titelblätter Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 1 1.1 RNA-Welt 1 1.2 Ribosomale 5S RNA 2 1.3 RNA-Strukturaufklärung 8 1.4 Kristallisation & Diffraktion der Thermus flavus 5S rRNA 9 1.5 Kristallstruktur gegen Lösungsstruktur 10 1.6 Grundlagen der Kristallographie 11 2. Problemstellung 16 3. Material und Methoden 17 3.1 Material 17 3.2 Methoden 23 3.2.1 Nukleinsäure-Aufreinigung 23 3.2.2 Gelelektrophorese 26 3.2.3 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 30 3.2.4 DNA-Amplifikation und Mutagenese 32 3.2.5 in-vitro Rekombination und Klonierung 35 3.2.6 in-vitro Transkription 41 3.2.7 Prozessierung von RNA 42 3.2.8 Proteinexpression von TflL18 45 3.2.9 Chemische Synthese von RNA-Oligonukleotiden 49 3.2.10 Kristallisation 50 4. Ergebnisse 56 4.1 Thermus flavus 5S rRNA Mutanten 56 4.2 Charakterisierung thermophiler 5S rRNA Bindungsproteine 72 4.3 Strukturaufklärung von Thermus flavus 5S rRNA Domänen 82 5. Diskussion 104 5.1 RNA-Kristallisation 104 5.2 Kristallisation von Oligoribonukleotiden 106 5.3 RNA-Strukturmotive 108 5.4 in-vitro Transkription und Prozessierung 111 5.5 Ribosomale Bindungsproteine der 5S rRNA 112 6. Ausblick 114 7. Zusammenfassung / Summary 115 8. Literaturverzeichnis 117 9. Anhang 125 9.1 Abkürzungsverzeichnis 125 9.2 Sequenzen, ALKABRID, Kristallisationsscreen 127 9.3 Eigene Publikationen 130 9.4 Lebenslauf 132 9.5 Danksagung 133

Ergänzende Angaben:
Online-Adresse:	http://www.diss.fu-berlin.de/2001/275/index.html
Sprache:	Deutsch
Keywords:	ribosome, 5S rRNA, RNA processing, crystallization, microgravity, structural water
DNB-Sachgruppe:	30 Chemie
Datum der Disputation:	09-Nov-2001
Entstanden am:	Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie, Freie Universität Berlin
Erster Gutachter:	Prof. Dr. Volker A. Erdmann
Zweiter Gutachter:	Prof. Dr. Christian Betzel
Kontakt (Verfasser):	vallazza@chemie.fu-berlin.de
Kontakt (Betreuer):	erdmann@chemie.fu-berlin.de
Abgabedatum:	19-Dec-2001
Freigabedatum:	20-Dec-2001

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