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FU Berlin
Digitale Dissertation

Olaf Schaefer :
Proteinkinase C in der Signaltransduktion promyeloider 32D Zellen
Proteinkinase C in the signaltransduktion of promyeloide 32D cells

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|Zusammenfassung| |Inhaltsverzeichnis| |Ergänzende Angaben|

Zusammenfassung

Die Enzyme der Proteinkinase C Familie bilden eine Gruppe von Serin/Threonin-Kinasen. Sie erfüllen wichtige Aufgaben in der Signaltransduktion bei Zellwachstum, Differenzierung, Immunreaktion und Cancerogenese. Für die Aufklärung ihrer Funktion ist es gleichermaßen wichtig, die einzelnen PKC-Substrate zu identifizieren und die Auswirkung einer PKC-Aktivierung auf zellulärer Ebene zu analysieren.
Die Proteine DAP1, Diff6, TCTP und das PDI-Homologe werden in vivo nach einer Stimulierung mit dem PKC-Aktivator Phorbolester phosphoryliert. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde deshalb untersucht, ob diese Proteine PKC-Substrate sind.
Während PDI bereits als aufgereinigtes GST-Fusionsprotein vorlag, waren für die anderen potentiellen PKC-Substrate weder aufgereinigtes Protein noch die cDNAs zugänglich. Diese cDNAs wurden daher zunächst aus Maus 32D Zellen kloniert und in GST-Expressionsplasmide überführt. Nach ihrer Expression und Reinigung wurden alle Proteine in in vitro Kinasereaktionen mit PKCd und PKCe sowie, in Erweiterung der Aufgabenstellung, mit PKCa eingesetzt. Dabei wurde gezeigt, dass die o.g. Proteine keine Substrate dieser PKCs sind, sondern wahrscheinlich Substrate tiefer stehender Kinasen.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die nachgelagerten Effekte der PKC-Aktivierung in den promyeloiden 32D Zellen betrachtet. Hierzu wurden die PKC-abhängigen Veränderungen im Transkriptom der Zellen untersucht.
Dabei wurde zunächst eine negative Regulation der PKCe-Expression in 32D Zellen durch PKCd festgestellt. Für das tumorassoziierte Protein TCTP trat daneben eine deutliche Steigerung der mRNA-Expression sowohl in den 32D PKCd- als auch in den 32D PKCe-Zellen auf. Weiterhin wurde die mRNA für das antiinflammatorische Protein Lipocortin 1 in 32D Zellen durch PKCd und PKCe stark herunterreguliert. Bei der Untersuchung verschiedener Mitglieder der MAP Kinase Kaskade zeigte sich dagegen eine PKC-abhängige Erhöhung der mRNA-Expression für MAPKAPK2.
Durch die Depletion von Lipocortin 1 kann es dabei zu einer dauerhaften Aktivierung des MAPK/ERK Wegs und zur Steigerung entzündlicher Reaktionen kommen. Die PKC-vermittelte Expressionssteigerung von MAPKAPK2 zusammen mit ihrer gleichzeitigen Aktivierung könnte dabei zur Einleitung von Differenzierung und Immunreaktion in den 32D Zellen beitragen.
 

Inhaltsverzeichnis

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Inhaltsverzeichnis 1
1 Einführung 5
1.1 Zellen reagieren spezifisch auf Signale aus ihrer Umgebung 5
1.2 Die Proteinkinase C Familie 6
1.3 Entwicklung und Differenzierung von 32D Zellen 15
1.4 Die Untersuchung differentieller Genexpression mit DNA Arrays 18
2 Zielsetzung der Arbeit 25
3 Material 24
4 Methoden 29
4.1 Kultivierung eukaryotischer Zellen 29
4.2 Proteinchemische Methoden 31
4.3 Molekularbiologische Methoden 37
4.4 cDNA-Array 49
4.5 TaqMan-Analyse 54
5 Ergebnisse 60
5.1 Überprüfung von DAP1, Diff6, PDI und TCTP auf ihre Phosphorylierbarkeit durch PKC 60
5.2 Proteinkinase C regulierte Genexpression 67
6 Diskussion 89
6.1 DAP1, Diff6, TCTP und PDI sind keine PKC-Substrate 89
6.2 PKCe in 32D Zellen 90
6.3 Erhöhte TCTP-Expression in 32D PKCd- und 32D PKCe-Zellen 91
6.4 PKC-vermittelte Expression von Adhäsionsmolekülen 93
6.5 PKC-vermittelte Reduktion der Lipocortin 1-Expression 93
6.6 PKC-vermittelte Steigerung der MAPKAPK2-Expression 95
6.7 Veränderungen im Transkriptom von 32D Zellen durch die Überexpression von PKC 98
6.8 Möglichkeiten der Expressionsanalyse mit cDNA-Arrays 99
7 Zusammenfassung 102
8 Abstract 103
9 Literaturverzeichnis 104
10 Abkürzungsverzeichnis 119
11 Abbildungsverzeichnis 123
12 Lebenslauf und Veröffentlichungen 125
13 Danksagungen 126

Ergänzende Angaben:

Online-Adresse: http://www.diss.fu-berlin.de/2001/5/index.html
Sprache: Deutsch
Keywords: PKC 32D signal transduction
DNB-Sachgruppe: 32 Biologie
Datum der Disputation: 15-Jan-2001
Entstanden am: Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie, Freie Universität Berlin
Erster Gutachter: Prof. Dr. Brigitte Wittmann-Liebold
Zweiter Gutachter: Prof. Dr. Ferdinand Hucho
Kontakt (Verfasser): olaf_schaefer@gmx.net
Kontakt (Betreuer): nephrologie@mh-hannover.de
Abgabedatum:16-Jan-2001
Freigabedatum:17-Jan-2001

 

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