Zusammenfassung
Die Kernhülle (NE) ist eine der am wenigsten
charakterisierten Strukturen in der eukaryotischen Zelle. Die vorgelegte
Arbeit handelt von der Identifikation neuer Komponenten der inneren Kernmembran
(INM) und deren Charakterisierung. Zusätzlich wurden Interaktionspartner
von LAP2β, einem bekanten Protein der INM, gesucht.
Durch eine Kombination von subzellulärer Fraktionierung und Werkzeugen
der Proteomanalyse wurde ein proteomischer Screen der NE durchgeführt.
Basierend auf den experimentellen Beweisen, dass INM-Proteine eine Extraktion
mit TritonX-100 überstehen, wurden zwei neue integrale Membran-Proteine
als INM-Proteine klassifiziert. Diese Proteine sind KIAA0810 und LUMA.
Deren Lokalisation in der INM wurde durch indirekte Immunofluoreszens von
transient transfizierten Zellen, die diese Proteine überexprimierten,
bestätigt.
LUMA, ein Protein mit der geschätzten Molekulargewicht von 45kDa,
hat keine Ähnlichkeit zu anderen bekannten Proteinen und besitzt keine
Homologie-Domänen. Das Hydropathie-Profil von LUMA lässt auf
vier Transmembran-Sequenzen mit einem großem hydrofilen Bereich zwischen
den ersten zwei schließen. Durch Überexpression von Deletionsmutanten
in COS7-Zellen konnte die Topologie von LUMA untersucht und die INM-Targeting-Domäne
identifiziert werden. Beide N- und C-Termini von LUMA zeigen zur ER-Lumen
während die große hydrofile Bereich zum Nucleoplasma hin orientiert
ist. Der kleinste Teil von LUMA, der für die INM-Lokalisierung ausreichend
ist, besteht aus den Aminosäuren 201-345, welche die zweite Hälfte
des hydrofilen Bereiches und die zweite Transmembran-Sequenz umfassen.
Überexpression von LUMA induziert einen markanten Phänotyp
in den Zellen - die NE sieht 'geschwollen' aus und beinhaltet vesikel-ähnliche
Strukturen. Zusätzlich sieht das nukleäre Chromatin weniger dicht
aus als in Kontrollzellen. Eine Runterregulation von LUMA führt zur
Bildung vesikel-ähnlicher Strukturen außerhalb des Kerns. Diese
Vesikel beinhalten Chromatin, während das Chromatin im Kern eine veränderte
Struktur erhält. Ein Chromosom-Bindungstest zeigte, dass LUMA Chromosomen
zu binden und diese zu dekondensieren fähig ist. Diese Beobachtungen
lassen vermuten, dass LUMA eine Rolle in der Genregulation und/oder Regulation
des Zellzyklus hat. Außerdem zeigen sie, dass die korrekte Menge
an LUMA für den Erhalt einer intakten NE notwendig ist.
Um die Funktionen der Kernhülle zu verstehen, ist ein detailliertes
Verständnis der Interaktionen zwischen deren Proteinen notwendig.
Um diese zu untersuchen wurden native Komplexe von LAP2beta isoliert und
charakterisiert. Durch die Nutzung verschiedener Techniken konnten nach
dem Solubilisieren der Membran mit n-dodecyl-beta-maltosid LAP2β beinhaltende
Komplexe von hohem Molekulargewicht isoliert werden. Neben LAP2β befand
sich auch LAP2ε in diesen Komplexen jedoch keine Lamina. Weitere
Experimente sind notwendig, um die isolierten Komplexe näher zu charakterisieren. |
