Zusammenfassung
Nach Beendigung der Sequenzierung des humanen Genoms wird sich die
Genomforschung auf die Untersuchung von Variationen im humanen Genom
konzentrieren. Deshalb sind effiziente Hoch-Durchsatz
Genotypisierungstechnologien zur Analyse von DNA-Markern, insbesondere für
"single nucleotide polymorphisms" (SNPs) besonders gefragt. Viele Methoden
wie DNA-Chips, gel-basierende Verfahren und Prozeduren, die auf
Mikrotiterplatten ausgeführt werden, wurden für die SNP-Analyse entwickelt.
Keine dieser Methoden kann jedoch mit der schnellen und hochaufgelösten
Detektion von Massenspektrometern konkurrieren. Besonders die
Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie
(MALDI-MS) hat die Analyse von Proteinen und DNA revolutioniert.
Nichtsdestotrotz wurde bald klar, dass eines der prinzipiellen Probleme der
DNA-Analyse mittels MALDI-MS darin besteht, eine genügend reine Probe zu
gewährleisten. Dies limitiert signifikant den Hoch-Durchsatz, da die Automation
mit derzeitigen Aufreinigungsmethoden umständlich und kostspielig ist. Der
entscheidende Vorteil der neuen Methoden, die in dieser Arbeit gezeigt werden,
besteht in der Verwendung empfindlichkeits-steigender DNA-Chemie, deren
Anwendung als "charge-tagging" bezeichnet wird. Diese
DNA-Modifikationschemie wurde in mehrere verschiedene molekularbiologische
Verfahren zur Generierung allel-spezifischer DNA-Produkte von SNPs
implemetiert. Deshalb werden Aufreinigungen und Aufkonzentrationen wie sie
jede andere Technologie, die MALDI-MS verwendet, nicht benötigt. Jede der
gezeigten Prozeduren beginnt mit einer PCR. Die "GOOD assays" und der
vereinfachte "GOOD assay" benötigen eine Primer-Extension für die Generierung
allel-spezifischer und ladungs-konditionierter DNA. Zusätzlich sind Prozeduren,
die Ligasen oder "Flap"-Endonukleasen für die Generierung solcher Produkte
benutzen, gezeigt. Unter allen diesen Methoden ist der vereinfachte "GOOD assay" potentiell der Beste, da dieser mit der kürzesten Reaktionssequenz und
völlig ohne Chemie auskommt. Der vereinfachte "GOOD assay" ist eine
aufreinigungs-freie, Ein-Topf- und 3-Schritt-Prozedur bestehend aus PCR,
Primer Extension und Phosphodiesterase II-Verdau gefolgt von
massenspektrometrischer Analyse, während für die "GOOD assays" in einem
zusätzlichen Schritt noch eine Alkylierungsreaktion nach dem
Phosphodiesterase-Verdau hinzukommt. Die "GOOD assays" und der
vereinfachte "GOOD assay" wurden mit einfachen Pipettierschritten bei
kleinst-machbaren Volumina, Inkubationen und thermozyklischen Schritten
durchgeführt, und sie wurden erfolgreich in einen automatisierten Prozess für die
Hoch-Durchsatz-Genotypisierung von SNPs implementiert. |
