Zusammenfassung
In dem ersten Teil der Dissertation sollte ein neuer Ansatz für das Design eines innovativen Gentransfervektor entworfen werden, mit dem Ziel effizienter als die bisher verfügbaren nicht-viralen Vektoren Gentransfer zu vermitteln. Die genaue Analyse des Mechanismus, der dem nicht-viralen Gentransfer zugrunde liegt, offenbarte die Schwachpunkte von den bis dato verwendeten nicht-viralen Gentransfervektoren. In diesem Zusammenhang stellten die Freisetzung aus den Endosomen, sowie der Transport des Transgens in den Zellkern stationärer Zellen die größten Barrieren dar. Das Design des neuen Gentransfervektors zielte folglich auf die Überwindung dieser beiden Barrieren ab. Mit Hilfe des arginin-reichen Motiv des HIV 1-TAT Protein, kurz TAT-Sequenz, das einerseits eine Proteintransduktionsdomäne und andererseits eine Kernlokalisierungssequenz in einem Peptid darstellt, sollten eben genau diese Barrieren überwunden werden können. Ein solches System hätte den Vorteil, dass mit einem Vektor zwei der am stärksten limitierenden Barrieren im Prozess des Gentransfers in einem Schritt überwunden werden könnten. Zu diesem Zweck sollte die TAT-Sequenz oligomerisiert werden und jedes der Oligomere als eigenständiger Vektor für den Gentransfer untersucht werden. Speziell sollte untersucht werden, ob der Grad der Oligomerisierung einen Einfluss auf die biophysikalischen Parameter der resultierenden Genvektoren hatte und ob diese Parameter im Zusammenhang mit dem Oligomerisierungsgrad mit der Gentransfereffizienz korrelierten.
In einem zweiten Teil dieser Dissertation sollte die Gentransfereffizienz von kationischen Polymeren, wie z.B. Polyethylenimin (PEI) 25 kDa und Polyamidoamin-Dendrimeren in vivo in die Mauslunge untersucht werden als denkbarer Ansatz, die Zystische Fibrose gentherapeutisch zu behandeln. In vorangegangen Untersuchungen erwiesen sich gerade PEI 25 kDa und Polyamidoamin-Dendrimere als effiziente Vektoren speziell Bronchialepithel auch unter Einfluss von in der Lunge natürlich vorkommende Surfactant in vitro zu transfizieren. Zu dem damaligen Zeitpunkt waren keine Daten zu der in vivo Gentransfereffizienz in die Lunge der beiden kationischen Polymere bekannt. Es sollte daher als erstes eine Methode zur intratrachealen Applikation von Gentransfervektoren entwickelt werden. In diesem Zusammenhang sollten nicht nur die Bedingungen für den Gentransfer der beiden kationischen Polymere optimiert werden, vielmehr sollte auch der Einfluss von Lungensurfactant auf die in vivo Gentransfereffizienz, sowie der zeitliche Verlauf der Transgenexpression und die Verträglichkeit mit möglicher inflammatorischen Antwort der Mauslunge untersucht werden. Des Weiteren sollte die Gentransfereffizienz der kationischen Polymere mit der von kationischen Lipiden, die zu dem damaligen Zeitpunkt bereits gut untersucht waren, verglichen werden. Welche der beiden Klassen von kationischen Genvektoren ist effizienter? Da vorangegangene Arbeiten anderer Gruppen liganden-modifizierte Vektoren für den gezielten rezeptorvermittelten Gentransfer sehr erfolgreich eingesetzt haben, sollte diese Möglichkeit zusätzlich für den Gentransfer in die Lunge untersucht werden. Des Weiteren sollten die in dem ersten Abschnitt entwickelten neuen Genvektoren basierend auf der TAT-Sequenz auf ihr Potenzial Gentransfer in vivo in die Lunge zu vermitteln untersucht werden.
Schließlich erscheint die Vernebelung von Genvektoren als die geeignetste Applikationsmethode in die Lunge in Hinblick auf zukünftige eventuelle humane Anwendungen. Von einer anderen Arbeitsgruppe wurden bereits erste sehr erfolgreiche Ergebnisse mit vernebelten PEI Polyplexen berichtet (Densmore et al., Mol Ther, 1, 180-8. 2000). Es ist jedoch aus der Literatur bekannt, dass die Gentransfereffizienz von PEI Polyplexen stark von dem Solvens, das zu ihrer Formulierung verwendet wird abhängig ist. In diesem Kontext sollte der Einfuß unterschiedlicher Solventien auf partikuläre Parameter vor und nach Vernebelung von PEI Polyplexen untersucht werden und diese wenn möglich mit der biologischen Aktivität, d.h. der Transfektionseffizienz korreliert werden. |
