Zusammenfassung
Für die beiden humaninfektiösen Trypanosomen-Subspezies Trypanosoma brucei
rhodesiense
und T. b. gambiense existiert ein Reservoir von Haus- und Wildtieren. Morphologisch sind sie
jedoch nicht von der allein tierinfektiösen Subspezies T. b. brucei unterscheidbar. Mit Hilfe
von biologischen, biochemischen oder molekularbiologischen Methoden gelingt eine
Differenzierung nur teilweise. Daher werden Testsysteme benötigt, die Tiere schnell und
zuverlässig als Träger humaninfektiöser Trypanosomen identifizieren.
In der vorliegenden Arbeit wurden 16 Trypanosomen-Referenzstämme und -klone (5 T. b.
brucei, 9 T. b. gambiense und 2 T. b. rhodesiense), sowie 18 Feldstämme und 7 -klone aus
Tieren und 4 Feldstämme aus Menschen in Bulutwe, einem Schlafkrankheits-Endemiegebiet
im Südosten Ugandas, durch die Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) charakterisiert. Es
sollte
untersucht werden, ob anhand der spezifischen Karyotypen Rückschlüsse auf ihre
Humanserumresistenz gezogen werden können.
Um ihr Verhalten gegenüber Humanserum zu bestimmen, wurden die Stämme im in
vitro-Humanserum-
Resistenztest (HSRT) und teilweise im Blutinkubations-Infektiositätstest (BIIT)
untersucht.
Die Referenzstämme und -klone verhielten sich im HSRT erwartungsgemäß sensitiv (T. b.
brucei) bzw. resistent (T. b. gambiense). Von den 2 T. b. rhodesiense-Stämmen verhielt sich
der eine, wie zu erwarten, resistent, der andere jedoch sensitiv, was sich durch einen Verlust
der Humanserumresistenz von T. b. rhodesiense nach Labortierpassagen bzw. Kultivierung
ohne Humanserum erklären lässt.
Von den 18 aus Tieren isolierten ugandischen Feldstämme verhielten sich 3 resistent, 6
subresistent und 9 sensitiv im HSRT. Die 7 Klone verhielten sich ebenfalls sensitiv, genau
wie ihre Mutterstämme. Diese Ergebnisse waren nur teilweise identisch mit früher
gewonnenen BIIT-Ergebnissen, was allerdings die Aussage unterstützt, dass T. b.
rhodesiense
ihre Humanserumresistenz verlieren können (s.o.). So zeigten ohne Humanserum
passagierte
Stämme bei meinen Untersuchungen z.T. einen geringeren Resistenzgrad als vorher,
während
2 von mir zusammen mit Humanserum passagierte Stämme einen höheren Resistenzgrad
aufwiesen.
Die 4 aus Menschen isolierten ugandischen Feldstämme verhielten sich im HSRT
erwartungsgemäß resistent.
Von den 5 für den BIIT ausgewählten, aus Tieren isolierten Feldstämmen verhielten sich 3
resistent, 2 jedoch subresistent, obwohl sie anhand früherer BIIT-Ergebnisse als resistent
eingestuft worden waren. Diese sich nur im Resistenzgrad unterscheidenden Ergebnisse
können trotzdem als übereinstimmend gewertet werden.
Die 3 ausgewählten menschlichen Isolate verhielten sich im BIIT erwartungsgemäß resistent.
Für die PFGE-Untersuchungen der Trypanosomen-Karyotypen mussten sowohl die
Probenaufbereitung als auch die Laufbedingungen zunächst optimiert werden.
Mit 4 verschiedenen PFGE-Parameterlisten (Lauf 0-III) konnten Chromosomenbanden von
95kbp bis 3Mbp in einem jeweils 4,5cm hohen Agarosegel aufgetrennt werden. Dabei
brachte
der Einsatz von 2x10 9 Trypanosomen pro ml PSG-Puffer zur Herstellung der
PFGE-Agaroseblöcke
und deren anschließender Verdau mit 1mg Proteinase K pro ml NDS-Puffer
für 48h gute Ergebnisse. Die DNA-Banden wurden 30min mit Ethidiumbromid gefärbt und
über Nacht entfärbt. Das Gel wurde anschließend über UV-Licht fotografiert, zur
Bildoptimierung in das Dokumentationsprogramm BioDoc ® (Biometra, Göttingen)
übertragen
und schließlich mit Hilfe des ScanPack 3.0 ® -Programmes (Biometra, Göttingen)
ausgewertet.
Die Untersuchungen zur Stabilität des Karyotypes von Trypanosomen zeigten, dass
Blutstrom- und prozyklische Formen, frühe und späte Antigenvarianten oder Feldstämme
und
aus diesen gewonnene Klone identische Karyotypen besitzen.
Die Karyotypen der Referenzstämme waren sehr unterschiedlich voneinander, und es ließen
sich keine Gemeinsamkeiten ausmachen. In den Bereichen der Mini- (MC) und großen
(MBC) Chromosomen zeigten alle Referenzen ungefähr vergleichbar viele
Chromosomenbanden (durchschnittlich 4-7 MC und 4-6MBC). Nur von den
Intermediär-Chromosomen
(IC) besaßen die T. b. gambiense-Stämme durchschnittlich weniger (0-4 IC)
als die nicht-gambiense-Stämme (3-6 IC). Eine Einteilung der Referenzen in
humanserumresistent bzw. -sensitiv aufgrund von PFGE-Ergebnissen war nicht möglich.
Auch konnten die 3 Trypanosoma brucei-Subspezies nicht eindeutig durch die PFGE
identifiziert werden.
Die aus Rindern und Schweinen in Bulutwe, Südost-Uganda isolierten Feldstämme stellten
sich in ihren Karyotypen sehr viel homogener dar als die aus Menschen isolierten. Letztere
waren untereinander genauso unterschiedlich wie die Referenzen. Ähnliche oder identische
Karyotypen verschiedener Stämme konnten jedoch nur auf einen identischen
Isolierungszeitraum bzw. dasselbe Isolierungstier zurückgeführt werden. Die durch das
Dendrogramm entstandene Einteilung der Referenz- und Feldstämme bzw. -klone in 5
Gruppen (I-V) zeigte ebenfalls, dass in nahezu jeder Gruppe sowohl Humanserum-resistente
bzw. -subresistente als auch -sensitive Stämme oder Klone enthalten sind. Gruppe IV
beinhaltet als einzige nur resistente T. b. gambiense-Referenzen. Vom Karyotyp eines
Stammes konnte also nicht auf seine Humanserumresistenz geschlossen werden. Auch
konnte
keine einzelne Bande identifiziert werden, die sich mit der Humanserumresistenz oder
-sensitivität
eines Stammes oder Klones in Verbindung bringen ließ.
Die PFGE kann als einfach erlern- und durchführbare Methode Trypanosomen-Stämme
spezifisch charakterisieren und selbst geringgradige Änderungen ihres Genotyps
nachweisen.
Trotzdem konnte in der vorliegenden Untersuchung anhand der Karyotypen der Stämme
nicht
auf ihre Humanserumresistenz oder Subspezies-Zugehörigkeit geschlossen werden. Grund
hierfür ist die relativ geringe Sensitivität der PFGE, die auf der Ebene der
Größenänderungen
von Chromosomen liegt. Diese Größenänderungen entstehen bei Trypanosomen jedoch
sehr
häufig und zwar aufgrund immer wieder willkürlich auftretender Gen-Rearrangements.
Um die Sensitivität der Methode zu erhöhen, könnte man, anstatt die intakten Chromosomen
aufzutrennen, diese zunächst an definierten Schnittstellen durch Restriktionsenzyme in
Chromosomen-Bruchstücke schneiden. Noch sensitiver, wenn auch
Kontaminations-gefährdeter,
wären PCR-Methoden, die eine Identifizierung von humaninfektiösen
Trypanosomen-Isolaten erlauben. |
