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FU Berlin
Digitale Dissertation

Andreas Albers :
Entwicklung und Charakterisierung einer Methode zum direkten ballistischen Transfer von Genen in Tumorzellen zur Herstellung von autologen Anti-Tumorvakzinen
Development and characterization of a method for direct ballistic transfer of genes into tumor cells, for production of autologous anti-tumor vaccines

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|Zusammenfassung| |Inhaltsverzeichnis| |Ergänzende Angaben|

Zusammenfassung

Die Schwachstelle aller Gentherapieansätze ist immer noch das Gentransferverfahren. Optimal zur klinischen Anwendung wäre eine Transfektionsmethode, durch die bei geringem Aufwand und ohne Sicherheitsrisiko eine effiziente Transfektion nur der gewünschten Zellen in ausreichender Anzahl erreicht werden könnte. Dabei sollte die Zelle ausschließlich in der erforderlichen Art und Weise verändert werden, ohne daß andere, ihr eigene Merkmale modifiziert werden. Die Methode des ballistomagnetischen Gentransfers stellt einen Ansatz zur Lösung dieses Problems dar (134). Sie ist jedoch dadurch limitiert, daß nur adhärente Zellen effektiv transfiziert werden können. Es muß also vor der Transfektion aus dem vom Patienten exzidierten Tumorgewebe eine adhärente Zellkultur hergestellt werden. Bei den von uns am Centrum Somatische Gentherapie, Berlin durchgeführten Gentherapiestudien stellt dies eine beträchtliche Einschränkung dar, da es bei der Kultivierung der aus Tumormaterial gewonnenen Zellen zu einer Selektion der adhärierenden Zellklone kommt und demzufolge alle nichtadhärenten Tumorzellen verworfen werden. Hierdurch wird der Tumorzellpool, aus dem später die gentherapeutischen Vakzine hergestellt werden, eingeschränkt. Mit zunehmender Kultivierungsdauer nimmt darüberhinaus der Anteil der schnellwachsenden Tumorzellen gegenüber den langsam wachsenden in der Kultur zu. Zum Zeitpunkt der Transfektion repräsentieren die zur Herstellung der Vakzine verwendeten Tumorzellen den Tumor, aus dem sie gewonnen wurden, also nur noch teilweise. Die längerfristige Kultivierung der operativ entnommenen Tumorzellen ist auf etwa 30% der operierten Patienten begrenzt, da nur bei diesem Anteil der Patienten die Zellen erfolgreich in Kultur gehalten werden können. Im Rahmen meiner Arbeit wurde der ballistomagnetische Gentransfer für die Anwendung in klinischen Gentherapiestudien modifiziert. Der Arbeitsablauf wurde optimiert und seine Effektivität gesteigert. Um Zellen unabhängig von ihren Adhärenzeigenschaften transfizieren zu können, werden die Zellen nun auf Petrischaleneinsätze, die mit einer mikroporösen Polycarbonatmembran bespannt sind, kurzzeitig in Form einer Monolayer aufgebracht. Diese Methode wird im folgenden MIP-Methode (Mikroporöse-Polycarbonatmembran-Methode) genannt. Durch Kombination des ballistomagnetischen Gentransfers mit der MIP-Methode ist es jetzt prinzipiell möglich, die autolog gewonnenen Tumorzellen aller Patienten ohne vorherige Kultivierung direkt zu transfizieren. Dies erlaubt die Herstellung von gentherapeutischen Vakzinen aus Tumorzellen mit immunologisch unveränderter Zelloberfläche und damit erhöhter Wahrscheinlichkeit, die für die Immunisierung relevanten Strukturen wie z.B. Tumorantigene, dem Immunsystem des Patienten zu präsentieren. Zellen, die unter Anwendung der MIP-Methode ausgesät wurden, konnten zu 89% im Durchschnitt der verwendeten Zellinien nach ballistischem Gentransfer von der Polycarbonatmembran geerntet werden. Bei Anwendung der Vergleichsmethode nach Burkholder et al. (123) konnten 58% der Zellen zurückgewonnen werden. Auch die magnetische Separation war effizienter, wenn die Zellen vorher mit der MIP-Methode ausgesät wurden. So erhielt man nach dem Gentransfer im Mittel über die verwendeten Zellinien 1.7 mal mehr Zellen und nach magnetischer Separation insgesamt 3.7 mal mehr Zellen als mit der Vergleichsmethode. Die Transfektionsraten, die sich nach durchflußzytometrischer Auswertung für beide Methoden ergaben, unterschieden sich nicht signifikant. Betrachtet man jedoch die absolute Zahl der transfizierten Zellen, so ist die Anwendung der MIP-Methode eindeutig vorteilhafter, da hierbei mehr Zellen nach dem ballistischen Gentransfer für die magnetische Separation zur Verfügung stehen und die magnetische Anreicherung effizienter ist. Mit einer Computersimulation wurden die optimalen Bedingungen für den ballistischen Gentransfer ermittelt. Aufgrund der erhaltenen Daten konnten konkrete Vorschläge für eine praktische Umsetzung im Labor gemacht werden. Diese Erkenntnisse können direkt genutzt werden, um die Herstellung von Gentherapeutischen Vakzinen für zukünftige Studien und klinische Anwendungen noch effektiver zu gestalten.

Inhaltsverzeichnis

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Titelblatt, Inhaltsverzeichnis
1. Zusammenfassung 8
2. Einleitung 10
2.1 Hintergrund: Karzinogenese 10
2.2 Einführung zum Thema Gentherapie 13
2.3 Übersicht über Gentherapiestrategien und Beispiele für Kandidatengene 14
2.4 Suizidgentherapie 15
2.5 Tumorsuppressor- und Anti-Onkogentherapie 16
2.6 Supportive Gentherapiemaßnahmen 16
2.7 Aktive Krebs-Immungentherapie 17
2.8 Gentransfer in der Gentherapie 32
2.9 Zielsetzung der Arbeit 43
3. Materialien 44
3.1 Verwendete Geräte 44
3.2 Verwendete Materialien und Chemikalien 45
3.3 Bakterienstämme und Zellinien 46
3.4 Zellkulturmedien 46
3.5 Plasmidkonstrukte und Oligdesoxyribonukleotide 47
3.6 Puffer, Lösungen und Medien 47
4. Methoden 49
4.1 DNA-Präparation und Aufreinigung 49
4.2 Zellkulturarbeiten 53
4.3 Ballistomagnetischer Gentransfer 59
4.4 Antikörperfärbung zum Nachweis der CD40L-Expression im Durchflußzytometer 67
4.5 Messungen mit dem Durchflußzytometer 68
4.6 ELISA zur in vitro Quantifizierung der Zytokin-Expression 74
4.7 Näherungsformel zur Bestimmung der bei der MIP-Methode maximal einsetzbaren Zellzahl 76
4.8 Computerprogramm zur Simulation des Beschießens von Zellen 80
4.9 Fehlerbetrachtung der Versuchsergebnisse 83
5. Ergebnisse 84
5.1 Begriffsdefinitionen 84
5.2 Die MIP-Methode ermöglicht ballistischen Gentransfer in Zellen unabhängig von ihrer Fähigkeit zu adhärieren 84
5.3 Kotransfektion von Primärkulturen mit GM-CSF und IL-7 98
5.4 Computersimulation des ballistischen Gentransfers 100
6. Diskussion 106
6.1 Statistische Auswertung der Ergebnisse 106
6.2 Auswertung der durchflußzytometrischen Messungen 106
6.3 MIP-Methode 108
6.4 Berechnung der auszusäenden Zellzahl 109
6.5 Vergleich der MIP-Methode mit der Burkholder-Methode 109
6.6 Ballistischer Gentransfer 111
6.7 Computersimulation des ballistischen Gentransfers 114
7. Literaturverzeichnis 116
8. Anhang 128
8.1 Abkürzungsverzeichnis 128
8.2 Protokoll: Ballistomagnetischer Gentransfer mit der MIP Methode 129
9. Curriculum Vitae 132
10. Publikationsliste 135

Ergänzende Angaben:

Online-Adresse: http://www.diss.fu-berlin.de/2002/177/index.html
Sprache: Deutsch
Keywords: genetherapy, zytokines, tumor vaccine, gene transfer, interleukin-7, GM-CSF, ballistic, transfection
DNB-Sachgruppe: 33 Medizin
Datum der Disputation: 25-Jun-2002
Entstanden am: Fachbereich Humanmedizin, Freie Universität Berlin
Erster Gutachter: Professor Dr. Burghardt Wittig
Zweiter Gutachter: Professor Dr. Werner Rosenthal
Kontakt (Verfasser): andreasalbers@planet-interkom.de
Kontakt (Betreuer): bw@zedat.fu-berlin.de
Abgabedatum:03-Sep-2002
Freigabedatum:06-Sep-2002

 

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