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FU Berlin
Digitale Dissertation

Felix Bermpohl :
Demonstration and characterization of the endopeptidase activity of dipeptidyl peptidase IV (DPP IV)
Nachweis und Charakterisierung der Endopeptidase-Aktivität der Dipeptidylpeptidase IV (DPP IV)

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Abstract

Dipeptidyl peptidase IV (DPP IV, CD26) is a homodimeric type II membrane protein that is found on the cell surface of many solid tissues and different subtypes of lymphocytes in mammals. DPP IV is a member of the prolyl oligopeptidase family (S9) within the clan SC of non-classical serine peptidases. DPP IV is known to exhibit a well characterized exopeptidase activity specific for proline residues. This doctoral thesis describes a novel, specific endopeptidase activity of DPP IV. The enzyme was isolated in a three step purification procedure that included concanavalin A chromatography and immunoaffinity chromatography. The purified DPP IV was submitted to both a gelatin zymography assay and a soluble proteolytic assay in order to demonstrate and investigate its endopeptidase activity. Substrate specificity was detected for denatured fibrillar collagens (types I, II, III and V). Denatured basement membrane collagen type IV was also cleaved, but at a lower rate, whereas native collagens, albumin, fibronectin and the enzyme itself were not digested by DPP IV at all. 1 mg DPP IV was found to degrade 7 x 10-6 µmol of denatured type I collagen per min under optimal conditions of 37°C at pH 7.4. Cleavage products were detected on immunoblots as multiple peptide bands in a stepladder pattern, suggesting that DPP IV recognises multiple cleavage sites within the collagen chains. Endo- and exopeptidase activities of DPP IV showed the same peptidase inhibitor profile, including similar inhibition by DFP, PMSF and diprotin A and B, which suggests that both activities of DPP IV reside in a single active site. Immunohistochemical studies using anti-collagen-pAb revealed an accumulation of fibrillar collagen structures in the space of Disse of DPP IV-deficient Fischer-344-rats, indicating a disturbed collagen metabolism in these animals. The biological relevance of DPP IV endopeptidase activity should be seen in context with other collagenases and gelatinases, as well as with DPP IV exopeptidase activity. Therefore, DPP IV might participate in processes such as final collagen degradation, cellular adhesion to collagens, cellular translocation through the ECM and resorption of proline containing peptides.

Table of Contents

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0 Titelblatt und Inhalt

1 Einleitung und Zielsetzung

1.1 Die proteolytischen Enzyme

1.2 Aufbau, Vorkommen und Funktion der DPP IV

1.2.1 Die Struktur der DPP IV

1.2.2 Die Gewebeverteilung der DPP IV

1.2.3 Die Exopeptidase-Aktivität der DPP IV

1.2.4 Die Endopeptidase-Aktivität der DPP IV

1.3 Die Großfamilie der Kollagene

1.3.1 Das Bauprinzip der Kollagene

1.3.2 Die Kollagentypen

1.3.3 Der Kollagenkatabolismus

1.4 Zielsetzung

2 Versuchstiere, Material und Methoden

2.1 Versuchstiere

2.2 Material

2.2.1 Geräte

2.2.2 Chemikalien und Verbrauchswaren

2.2.3 Antikörper

2.2.4 Puffer

2.3 Methoden

2.3.1 Proteinchemische Methoden

2.3.1.1 Allgemeine proteinbiochemische Verfahren

2.3.1.1.1 Proteinbestimmung

2.3.1.1.2 Bestimmung der DPP IV-Exopeptidase-Aktivität

2.3.1.2 Verfahren zur Isolierung von Membranfraktionen

2.3.1.2.1 Gewinnung von Rohmembranen aus Nierenrinden

2.3.1.2.2 Solubilisierung von Membranproteinen

2.3.1.3 Chromatographische Verfahren

2.3.1.3.1 Dünnschichtchromatographie

2.3.1.3.2 Affinitätschromatographie an Concanavalin A-Sepharose

2.3.1.3.3 Immunaffinitätschromatographie an mAk 13.4-Sepharose

2.3.1.3.3.1 Kopplung des mAk 13.4 an Protein G-Sepharose

2.3.1.3.3.2 Immunaffinitätschromatographie an mAk 13.4-Sepharose

2.3.1.4 Elektrophoretische Verfahren

2.3.1.4.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

2.3.1.4.2 Western-Blotting

2.3.1.5 Färbungen von PAGE-Gelen

2.3.1.5.1 Coomassie-Blue G-250

2.3.1.5.2 Silberfärbung

2.3.1.6 Nachweisverfahren auf Blot-Matrices

2.3.1.6.1 Ponceau-Rot

2.3.1.6.2 Substratfärbung zum Nachweis aktiver DPP IV

2.3.1.6.3 Immunblot

2.3.1.7 Enzymatische Verdauungen

2.3.1.7.1 Gelatin-Zymographie

2.3.1.7.2 Löslicher proteolytischer Assay

2.3.2 Histochemische Methoden

2.3.2.1 Kryostatschnittherstellung

2.3.2.2 DPP IV-Aktivitätshistochemie

2.3.2.3 Kollagen-Immunhistochemie mit polyklonalen Primärantikörpern

3 Ergebnisse

3.1 Reinigung und Charakterisierung von DPP IV aus der Nierenrinde

3.1.1 Reinigung von aktiver DPP IV

3.1.2 Darstellung von DPP IV-Formen in der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese

3.1.3 N-terminale Sequenzierung des 60 kD-Proteins

3.2 Etablierung zweier Assays zur Untersuchung gelatinolytisch aktiver Peptidasen

3.2.1 Gelatin-Zymographie

3.2.1.1 Herstellung von Gelatingelen

3.2.1.2 Gelatin-Zymographie mit Clostridium histolyticum-Kollagenase

3.2.2 Löslicher proteolytischer Assay mit Clostridium-histolyticum-Kollagenase

3.2.2.1 Einfluss der Kollagenasemenge auf die Kollagenspaltung

3.2.2.2 Nachweis von niedermolekularen Spaltprodukten durch Dünnschichtchromatographie

3.2.2.3 Nachweis von höhermolekularen Spaltprodukten bei niedrigeren Inkubationstemperaturen

3.2.2.4 Zeitabhängigkeit der Kollagenspaltung

3.2.2.5 Verschiedene Substrate im löslichen proteolytischen Assay

3.2.2.6 Einsatz von Inhibitoren im löslichen proteolytischen Assay

3.2.2.7 Densitometrische Quantifizierung von Kollagenbanden

3.3 Nachweis der DPP IV-Endopeptidase-Aktivität durch Gelatin-Zymographie

3.3.1 Einsatz der DPP IV-Präparation in den Zymographie-Assay

3.3.2 Einfluss von Elektrophoresebedingungen und Waschvorgang auf die Gelatinzymographie mit DPP IV

3.3.3 Einfluss von DPP IV-Menge und Inkubationsdauer auf die Gelatinolyse

3.4 Charakterisierung der DPP IV-Endopeptidase-Aktivität mit Hilfe des löslichen proteolytischen Assays

3.4.1 Einfluss der EDTA-Konzentration auf den löslichen proteolytischen Assay

3.4.2 Einfluss des pH auf die DPP IV-Endopeptidase-Aktivität

3.4.3 Einfluss der Inkubationstemperatur auf die DPP IV-Endopeptidase-Aktivität

3.4.4 Nachweis von Spaltprodukten durch Immunblotting

3.4.5 Untersuchungen zur Substrat-Spezifität der DPP IV-Endopeptidase-Aktivität

3.4.5.1 Natives Albumin, Fibronektin und Kollagen im löslichen proteolytischen Assay mit DPP IV

3.4.5.2 Die Spaltung denaturierten Kollagens der Typen I-V im Vergleich

3.4.6 Einfluss von Inhibitoren auf die DPP IV-Endopeptidase-Aktivität

3.4.6.1 Diprotin A und B

3.4.6.2 Aspartat-, Cystein-, Metallo- und Serinpeptidase-Inhibitoren

3.5 Untersuchungen zum DPP IV-Defizit deutscher Fischer-344-Ratten

3.5.1 Die DPP IV-Expression in Wistar- und Fischer-Ratten

3.5.1.1 Analyse der Con A-Eluate des Nierenrinden-Rohmembran-Solubilisats

3.5.1.2 Enzymhistochemie

3.5.2 Immunhistochemie

4 Diskussion

4.1 Die Spaltung von denaturiertem Kollagen durch DPP IV als Beweis der Endopeptidase-Aktivität

4.2 Ausschluss einer Kontamination

4.3 Die Spaltungsrate der DPP IV-Endopeptidase-Aktivität

4.4 Die Spaltprodukte der DPP IV-Endopeptidase-Aktivität

4.5 Die Spaltstellenspezifität der DPP IV-Endopeptidase-Aktivität

4.6 Die Substratspezifität der DPP IV-Endopeptidase-Aktivität

4.7 Das katalytische Zentrum der DPP IV-Endopeptidase-Aktivität

4.8 Die Kollagenbindungsdomäne der DPP IV

4.9 Mögliche biologische Funktionen der DPP IV-Endopeptidase-Aktivität

4.9.1 Beteiligung am Kollagenkatabolismus

4.9.2 Beteiligung an Zelladhäsionsprozessen

4.9.3 Beteiligung an der Translokation von Zellen *

4.9.4 Beteiligung an der Resorption von prolinhaltigen Peptiden

4.9.5 Funktion in Leber, Speicheldrüsen, Pankreasgang und Prostata

4.10 Die DPP IV im Kontext anderer proteolytischer Enzyme

5 Literaturverzeichnis

More Information:

Online available: http://www.diss.fu-berlin.de/2002/191/indexe.html
Language of PhDThesis: german
Keywords: dipeptidyl peptidase IV, DPP IV, endopeptidase, gelatin, collagen
DNB-Sachgruppe: 33 Medizin
Date of disputation: 13-Sep-2002
PhDThesis from: Fachbereich Humanmedizin, Freie Universität Berlin
First Referee: Prof. Dr. med. Werner Reutter
Second Referee: Prof. Dr. med. Friedrich Körber
Contact (Author): bermpohl@gmx.de
Contact (Advisor): olibaum@zedat.fu-berlin.de
Date created:18-Sep-2002
Date available:18-Sep-2002

 

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