Zusammenfassung
Helikasen sind ubiquitäre Motorproteine. Sie sind unentbehrlich für essentielle biologische Prozesse mit Beteiligung einzelsträngiger DNA (ssDNA) wie DNA-Replikation, -Reparatur und -Rekombination. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden Funktion und Reaktionsmechanismen der Helikase RepA mit Hilfe unterschiedlicher Methoden untersucht.
Die dreidimensionale Struktur von RepA (aus Plasmid RSF1010) ist bis ins Detail bekannt. RepA war die erste intakte hexamere replikative Helikase, deren Struktur gelöst wurde. RepA besitzt sechs ATP-Bindungsstellen, die auf den Grenzflächen zwischen zwei benachbarten Monomeruntereinheiten liegen. Die ATP-Bindungsstellen gehören zu den Walker A- und B-Motiven und enthalten die H1- und H2- Motive der DnaB-like Familie. Die Motive sind durch die Konsenssequenz für den P-Loop 40GAGKS44 und die Reste Asp140, Glu77, His179, die alle demselben Monomer angehören, und den Rest Arg207, der auf dem benachbarten Monomer liegt, definiert.
Nukleosidtriphosphate-Bindung durch RepA zeigt eine streng negative Kooperativität. Obwohl es sechs potentielle ATP-Bindungsstellen im RepA-Hexamer vorhanden sind, zeigen Fluoreszenzmessungen, dass lediglich drei von ihnen durch ATP-Analoga besetzt werden. RepA ist in Anwesenheit von ATPgS stabiler als in Anwesenheit von ADP (?G = 0,29 kcal/mol), die zusätzliche Phosphatgruppe in ATPgS hat einen signifikanten Einfluß auf die RepA-Stabilität.
ZirkularDichroismus, Röntgen- und Elektronmikroskopie zeigen, dass die ATT-Bindung eine Konformationsänderung in RepA bewirkt. Ferner zeigen Messungen der Fluoreszenzdepolarisation Bewegungen eines Segments um die ATP-Bindungsstelle herum während der ATP-Bindung, ATP-Hydrolyse und ssDNA-Bindung.
ssDNA stimuliert die ATPase-Aktivität von RepA unter sauren Bedingungen bei pH 5.3-6.0. Der sigmoidale Verlauf der Bindungskurven in An- und Abwesenheit von ssDNA deuten auf streng positive Kooperativität der ATP-Hydrolyse, wobei die zehn Basen langen Oligonukleotide optimale Stimulatoren der ATPase-Aktivität sind.
Lys43 (Walker A-Motiv) ist ein essentieller Rest bei Enzymen der DnaB-like Helikase-Familie. Der Austausch von Lys43 (Walker A-Motiv) gegen Alanin verhindert die ATP-Bindung und hydrolytische Aktivität.
Die Interaktion von RepA-Hexamer mit fluoreszenzmarkierter ssDNA wurde mit Hilfe von Fluoreszenz Korrelations Spektroskopie (FCS) und analytischer Ultrazentrifugation untersucht.
Eine optimale Bindung von ssDNA durch RepA konnte nur in Anwesenheit von ATPgS und bei pH 5.8 erreicht werden. Ohne ATPgS oder bei pH 7.6 war die Komplexbildung schwach. Die Bindungskurven zeigten keine Kooperativität und deuteten auf nur eine ssDNA-Bindungsstelle auf RepA.
Protein-DNA Photo-Crosslinking Untersuchungen zeigten ferner, dass nur eine Untereinheit der Helikase zur selben Zeit an der Interaktion mit DNA beteiligt ist. Dies schließt die Möglichkeit extensiver Windung der ssDNA um das Hexamer herum aus. Ein Komplex mit simultaner Bindung der DNA durch alle sechs Untereinheiten konnte nicht beobachtet werden.
RepA diente als Modellhelikase bei der Suche nach Inhibitoren. Kommerziell erhältliche Flavon-Derivate wie Luteolin, Morin, Myricetin und Dimyricetin ( ein Oxidationsprodukt von Myricetin) inhibieren die ATPase- und Entwindungsaktivität von RepA. Dimyricetin inhibiert beide Aktivitäten am effektivsten. Alle vier Substanzen inhibieren nicht-kompetitiv die ssDNA-abhängige ATPase-Aktivität vom RepA. Myricetin inhibiert bekanntlich auch das Wachstum grampositiver und gramnegativer Bakterien. Diese Flavone könnten daher als Basisstrukturen für die Entwicklung neuer pharmazeutischer Stoffe dienen.
Im Rahmen der Arbeit wurde ein Modell der ATP-Hydrolyse, Translokation entlang der ssDNA und Entwindung des DNA Doppelstrangs vorgeschlagen. |
