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FU Berlin
Digitale Dissertation

Kai-Uwe Wolf :
The internalization of human rhinovirus type 14 (HRV-14) in HeLa-, BHK- and BHK-ICAM-1- cells
Die Einschleusung von humanem Rhinovirus Typ 14 (HRV-14) in HeLa-, BHK- und BHK-ICAM-1- Zellen

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Abstract

It is generally accepted that virus receptors are the main determinants for permissiveness as shown for poliovirus by Holland and Mc Laren nearly for forty years. The early steps of reproduction of human rhinovirus type 14 (HRV 14) were studied to what ex-tent the virus receptor ICAM-1 alone determinates the infection of cells. BHK cells that lacks the virus receptor intercellular adhesion molecule 1 (ICAM 1) were not suscepti-ble by HRV-14. As permissive cells HeLa cells were used. To study the influence of the virus receptor about the susceptibility of cells BHK cells were transfected with ICAM-1 (BHK-ICAM-1 cells). I could show for HeLa cells that HRV-14 is internalized via coated pits and coated vesicles by receptor-mediated endocytosis. A pH-dependent entry mechanism could by demonstrated by exploiting the action of monensin as an ionophore which raises the pH in the acidic endosomes and lysosomes. The progeny of new rhinoviruses was detected by transmission electron microscopy and the measure of infectious virus by plaque titration. Differently, the HRV-14 infection proceeded at BHK-ICAM 1-cells. In contrast to HeLa cells virus internalization into BHK-ICAM-1 cells were receptor mediated, too. But nei-ther a synthesis of viral RNA nor a production of infectious rhinoviruses was detected. Long chains of virus particles were located in membrane tubes. Virus particles were lined up in these channels like pearls on a string, but did not induce a productive infec-tion. ICAM-1 acts as a functional virus receptor on the transfected cells as shown in infection experiments with coxsackievirus A21. This virus, as HRV-14, utilizes ICAM-1 as its receptor. Coxsackievirus A21 replicated in BHK-ICAM-1 cells in titers similar to those of HeLa cells. These results suggest that ICAM-1 was not sufficient to render transfected BHK cells permissive to HRV-14. The replication of HRV-14 in BHK-ICAM-1 cells was blocked directly during its uncoating or shortly after. It is not clearly if the blockade is localizing at the step of the initiation of viral translation or the step of the initiation of viral transcription.

Table of Contents

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0. Titelblatt und Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 1
1.1. Die Familie der Picornaviren 1
1.1.1 Das Humane Rhinovirus Typ 14 (HRV-14) 6
1.1.2 Die Virusstruktur von HRV-14 6
1.2. Virusrezeptoren 9
1.2.1. ICAM 1 als Virusrezeptor für HRV-14 12
1.3. Der Reproduktionsmechanismus von Picornaviren 16
1.4. Zielsetzung 22
2. Material und Methoden 23
2.1. Abkürzungen 23
2.2. Verwendete Medien 25
2.3. Verwendete Lösungen, Puffer und Seren 27
2.1. Eingesetzte Substanzen 14
2.4. Zellen 31
2.4.1. HeLa-Zellen 31
2.4.2. BHK-Zellen 31
2.4.3. BHK-ICAM-1-Zellen 31
2.4.3.1. Transfektion von BHK-Zellen mit ICAM 1 32
2.5. Propagierung von HRV-14 und Coxsackievirus A21 33
2.6. Hochreinigung von HRV-14 34
2.7. RNA-Synthese-Test 35
2.7.1. RNA-Synthese-Inhibitions-Test 37
2.8. Plaque-Test 38
2.8.1. Plaque-Reduktions-Test 39
2.9. Endpunktstitration 40
2.10. Elektronenmikroskopie 41
2.11. ELISA zum Nachweis von membranständigem ICAM 1 (ICAM 1-ELISA) 42
2.12. ELISA zum Nachweis von zellgebundenem HRV-14 (HRV 14-ELISA) 43
2.13. Gradientenzentrifugation 45
2.14. Die Markierung viraler Proteine mit 35S-Methionin 46
2.15. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 47
3. Ergebnisse 49
3.1. Die Einschleusung von HRV-14 in HeLa-Zellen durch rezeptorvermittelte Endozytose 49
3.1.1. Viruseinschleusung und morphologische Veränderungen in HeLa-Zellen im Elektronenmikroskop nach Infektion mit HRV-14 49
3.1.2. Die Beteiligung von ICAM 1 an der Einschleusung in HeLa-Zellen 51
3.1.2.1. Die Blockierung der Adsorption von HRV-14 mit Anti-ICAM 1 52
3.1.2.2. Die Kompetition der Adsorption von HRV-14 mit löslichem ICAM 1:Ig 54
3.1.2.3. Das pH-abhängige Uncoating von HRV-14 59
3.2. Die Einschleusung von HRV-14 in BHK-ICAM 1-Zellen 61
3.2.1. Der Nachweis von ICAM 1 auf BHK-ICAM 1-Zellen 1-Zellen 62
3.2.2. Viruseinschleusung und morphologische Veränderungen in BHK-ICAM 1-Zellen im Elektronenmikroskop im Vergleich zu BHK-Zellen nach Infektion mit HRV-14 63
3.2.3. Die Beteiligung von ICAM 1 an der Einschleusung von HRV-14 in BHK-ICAM 1-Zellen 66
3.2.3.1. Der Nachweis der Bindung von HRV-14 an BHK-ICAM 1-Zellen 66
3.2.3.2. Die Bestimmung der RNA-Synthese von HRV-14 in BHK-ICAM 1-Zellen 68
3.2.3.3. Die Bestimmung von infektiöser Virusnachkommenschaft von HRV 14 in BHK-ICAM 1-Zellen 69
3.2.3.4. Die Bestimmung von infektiöser Virusnachkommenschaft von HRV 14 im Vergleich zu Coxsackievirus A21 in BHK-ICAM 1-Zellen 71
3.2.3.5. Die Bestimmung von HRV-14-Proteinen in BHK-ICAM 1-Zellen im Vergleich zu HeLa- und BHK-Zellen 74
4. Diskussion 78
4.1. Verlauf der frühen Reproduktionsschritte von HRV-14 in HeLa-Zellen 78
4.2. Einfluss von ICAM 1 als Virusrezeptor von HRV-14 auf die Adsorption und Penetration von HRV-14 in transfizierte BHK-ICAM 1-Zellen 79
4.3. Einfluss von virusbindenden Rezeptoren auf die Permissivität von transfizierten Zellen 81
4.4. Ablauf der frühen Reproduktionsschritte am Beispiel von Picornaviren, Semliki Forest Virus und Influenzaviren 83
4.4.1. Wechselwirkung des Virus mit dem Virusrezeptor und Aufnahme des Virus in die Zelle 83
4.4.2. Uncoating und Freisetzung der viralen RNA 85
4.4.3. Initiation der Translation zu Beginn des ersten Replikationszyklusses 88
4.5. Mögliche Ursachen des Effekts von zellgebundenem ICAM 1 auf die Aufnahme von HRV-14 in BHK-ICAM 1-Zellen im Unterschied zu HeLa-Zellen 93
5. Zusammenfassung 96
6. Literatur 97

More Information:

Online available: http://www.diss.fu-berlin.de/2002/268/indexe.html
Language of PhDThesis: german
Keywords: Human rhinovirus 14 Intercellular adhesion molecule-1 Virus entry Susceptibility
DNB-Sachgruppe: 33 Medizin
Date of disputation: 13-Dec-2002
PhDThesis from: Fachbereich Humanmedizin, Freie Universität Berlin
First Referee: Prof. Dr. Heinz Zeichhardt
Second Referee: Priv.Doz. Dr. Mathias Pauschinger
Contact (Author): ku_wolf@t-online.de
Date created:05-Dec-2002
Date available:06-Dec-2002

 

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