Zusammenfassung
Die Kompaktierung von DNA in geordnete Strukturen scheint eine zentrale Rolle in der Regualtion der Gentranskription zu spielen. Während der letzten Jahre sind diverse Proteinkomplexe identifiziert worden, die für die Aktivierung oder Inaktivierung der Transkription von Genen verantwortlich sind und die Chromatin-umordnende Aktivität besitzen oder Enzyme enthalten, die Histone kovalent modifizieren.
Die Inaktivierung von großen DNA Domänen durch Kompaktierung in eine geschlossene Chromatinstruktur wird als "Chromatin Silencing" bezeichnet. Diese Art der Inaktivierung spielt eine Rolle in der Regulation der Genexpression und ist assoziiert mit Chromosomenstrukturen, die in der epigenetischen Vererbung eine Rolle spielen.
Das Silent information regulator (Sir2) Protein ist eine Schlüsselkomponente des Silencing Apparates in Hefe. Sir2 ist ein Enzym, welches die Deacetylierung von Proteinen an die Hydrolyse von NAD+ koppelt und notwendig für Silencing an den "mating type" Loci, den Telomeren und den ribosomalen DNA Einheiten in Saccharomyces cerevisiae ist. In dieser Arbeit habe ich die Rolle der enzymatischen Aktivität bei der Bindung von Silencing-Komplexen an verschiedene Loci untersucht.
Im einzelnen habe ich die Bildung von Silencing Komplexen auf DNA in Zellen untersucht, die sir2-H364Y oder sir2-G262A Mutationen tragen, durch welche die enzymatische Aktivität von Sir2 verloren geht. Ich zeige, daß sowohl die Assoziation des SIR Komplexes (Sir2/Sir4 and Sir3) mit DNA der Telomeren und des HML-E silencers, als auch die Lokalisation von Sir2-GFP, Sir3-GFP und GFP-Sir4 zu telomerischen Foci in Zellen, die eine enzymatisch inaktive Variante von Sir2 exprimieren, verloren geht. Im Gegensatz dazu bindet Sir2 mit annähernd gleicher Effizienz sowohl in SIR2 als auch in sir2-H364Y Zellen an rDNA. Außerdem ist sir2-H364Y, genauso wie Sir2, im Nukleolus lokalisiert. Ich konnte weiterhin zeigen, dass an rDNA-Einheiten gebundenes Histon H4 hypoacetyliert ist. Die Acetylierung von Histone H4 in rDNA und Telomeren ist erhöht in Zellen, die entweder kein Sir2 Protein exprimieren oder das sir2-H364Y-Allel tragen. Dies legt nahe, dass Sir2 unmittelbar Histone in diesen Regionen deacetyliert. Im Einklang mit dienen Beobachtungen steht das Ergebnis, dass eine Mutation von Lysin 16 des Histon H4 Proteins zu Glutamin oder die Deletion der Aminosäuren vier bis 30 des N-Terminus von Histone H3 zu einem dramatischen Verlust des rDNA Silencing führt. Schließlich kann ich zeigen, dass Sir3 in einem sir4D Stamm nur dann mit rDNA assoziiert ist, wenn Sir2 enzymatisch aktiv ist. Dies legt nahe, dass Sir3 ohne Interaktion mit einem der bisher bekannten Silencing Proteine an Chromatin binden kann. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Modifikation von Histonen oder anderen Proteinen des Chromatins durch Sir2 eine Bindungsstelle für Silencing-Komplexe in Chromatin eröffnet. |
