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FU Berlin
Digitale Dissertation

Stephanie Wälter :
Analysis of huntingtin aggregation in mammalian cells and identification of HIP1-interacting proteins
Untersuchung der Huntingtinaggregation in Säugetierzellen und Identifizierung von HIP1-interagierenden Proteinen

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Abstract

Huntington`s Disease (HD) is an inherited, progressive neurodegenerative disorder caused by an elongated polyglutamine repeat located at the N-terminus of huntingtin. The pathomechanism of HD as well as the normal function of huntingtin are unclear. HD exon 1 proteins with a polyglutamine tract in the pathological range (> 37 glutamines) form protein aggregates in vitro. In addition, the accumulation of insoluble polyglutamine-containing protein aggregates in intranuclear and perinuclear inclusions has been detected in brains of HD transgenic mice and HD patients, leading to the hypothesis that HD is caused by the accumulation of protein aggregates in neuronal inclusions. To study the aggregation of huntingtin in more detail, stable, inducible 293 Tet-Off cell lines producing HD exon 1 proteins with 20, 51 and 83 glutamines were established in this work. In this cell model, the huntingtin exon 1 proteins with a polyglutamine tract in the pathological range (51 and 83 glutamines), but not in the normal range (20 glutamines), form perinuclear inclusions. These structures contain aggregated, ubiquitinated huntingtin exon 1 protein with a fibrillar morphology. The inclusion bodies are formed at centrosomes and are surrounded by vimentin filaments. Immunofluorescence and electron microscopy revealed that the 20S, 19S and 11S subunits of the 26S proteasome, the molecular chaperones BiP, Hsp70, and Hsp40 as well as the RNA-binding protein TIA-1, the potential chaperone 14-3-3, and a-synuclein colocalize with the perinuclear inclusions. Inhibition of the proteasome activity resulted in a 2-fold increase in the amount of aggregates, indicating that the inclusion bodies accumulate when the capacity of the ubiquitin-proteasome system is exhausted. In 293 Tet-off cells, inclusion body formation also resulted in cell toxicity and ultrastructural changes such as indentations and disruption of the nuclear envelope. Together these findings suggest, that under normal conditions mutant HD exon 1 fragments are transported to the proteasome for proteolytic digestion. HD exon 1 fragments with a long polyQ repeat polymerize and resist degradation, instead recruiting additional proteins to the inclusion bodies and forming the "degrasome". To gain insight into the normal function of huntingtin we have screened for huntingtin interacting proteins using the yeast two-hybrid system and discovered the huntingtin interacting protein 1 (HIP1). It is shown that HIP1 is a multidomain protein containing an N-terminal ENTH domain, a central coiled-coil forming region and a C-terminal actin-binding domain. By affinity chromatography three HIP1 associated proteins were identified, clathrin heavy chain, a-adaptin A and C. In vitro binding studies revealed that the central coiled-coil domain is required for the interaction of HIP1 with clathrin, whereas DxF-motifs located upstream to this domain are important for the binding of HIP1 to the C-terminal "appendage" domain of a-Adaptin A and C. Expression of full-length HIP1 in mammalian cells resulted in a punctate cytoplasmic immunostaining characteristic of clathrin-coated vesicles. In contrast, when a truncated HIP1 protein containing both the DxF-motifs and the coiled-coil domain was overexpressed, large, perinuclear vesicle-like structures containing HIP1, huntingtin, clathrin and internalized transferrin were observed, indicating that HIP1 is an endocytic protein. The structural integrity of HIP1 seems to be crucial for the maintenance of a normal vesicle size in vivo.

Table of Contents

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  Titelblatt, Inhaltsverzeichnis  
1. Einleitung 1
2. Untersuchung der Aggregatbildung von HD Exon 1 Proteinen in Säugetierzellen 3
2.1 Ergebnisse 7
2.1.1 Herstellen von stabilen Zelllinien 7
2.1.2 Bestimmung der optimalen Doxycyclinkonzentration 8
2.1.3 Bestimmung der optimalen Induktionszeit 10
2.1.4 Die Expression von HD Exon 1 Proteinen mit langen Polyglutaminketten führt zur Bildung von ubiquitinierten Aggregaten
 11
2.1.5 Zeitabhängigkeit der Aggregatbildung 13
2.1.6 Die Expression von HD Exon 1 Proteinen mit langen Polyglutaminketten führt zur Bildung von perinuklearen Aggregaten
 14
2.1.7 Cytoplasmatische Aggregate colokalisieren mit dem Centrosom und führen zur zellulären Umverteilung von Vimentin
 15
2.1.8 Colokalisation des Proteasoms mit HD Exon 1 Aggregaten 17
2.1.9 Die Inhibierung des Proteasoms verstärkt die Aggregationsbildung 18
2.1.10 Rekrutierung des ER-Chaperons BiP/Grp78 in die perinuklearen Einschlußkörper
 20
2.1.11 Colokalisierung von TIA-1, 14-3-3e und a-Synuclein 22
2.1.12 Ultrastruktur der perinuklearen Einschlußkörper 24
2.1.13 Die Expression von mutierten Huntingtinproteinen ist toxisch für 293 Tet-Off Zellen
 27
2.2. Diskussion 27
3. Identifizierung und Charakterisierung von HIP1-interagierenden Proteinen
 37
3.1 Ergebnisse 37
3.1.1 Strukturanalyse von HIP1 37
3.1.2 Affinitätsreinigung von HIP1-interagierenden Proteinen 39
3.1.3 Identifizierung der HIP1-interagierenden Proteine durch Massenspektrometrie und Immunblotting
 39
3.1.4 HIP1 Fragmente, die DxF-Motive enthalten, assoziieren direkt mit der a-Adaptin "Appendage"-Domäne
 43
3.1.5 Die coiled-coil-bildende Domäne in HIP1 ist entscheidend für die Bindung an die schwere Kette von Clathrin
 45
3.1.6 HIP1 ist mit Clathrin-bedeckten Vesikeln assoziiert 46
3.1.7 Die Überexpression von HIP1 (218-604) in COS-1 Zellen induziert die Bildung von großen vesikelartigen Strukturen
 48
3.2 Diskussion 51
4. Materialien und Methoden 57
4.1 Materialien 57
4.1.1 Bakterienstämme 57
4.1.2 Zelllinien 57
4.1.3 Plasmidvektoren 58
4.1.4 Medien und Puffer 60
4.1.5 Oligonukleotide 61
4.1.6 Antikörper 63
4.1.7 Enzyme, Proteine und DNA 64
4.1.8 Chemikalien und Säulenmaterialien 65
4.1.9 Kits 67
4.1.10 Laborausstattung, Geräte und Zubehör 67
4.2 Methoden 70
4.2.1 Grundlegende molekularbiologische Methoden 70
4.2.1.1 DNA-Plasmidpräparation mit Qiagen-Kits 70
4.2.1.2 DNA-Plasmidpräparation über CsCl-Gradient 71
4.2.1.3 Konzentrationsbestimmung der DNA 72
4.2.1.4 Restriktionsverdau von DNA 72
4.2.1.5 Dephosphorylierung von 5´-Phosphatgruppen 72
4.2.1.6 Aufreinigung von DNA-Fragmenten 73
4.2.1.7 DNA Agarose-Gelelektrophorese 73
4.2.1.8 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 74
4.2.1.9 Ligation von DNA-Fragmenten 74
4.2.1.10 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 75
4.2.1.11 DNA-Sequenzierung 75
4.2.1.12 Plasmidkonstruktionen 76
4.2.1.12.1 pTet-CMV-Hyg-CAG20, -CAG51 und -CAG83 76
4.2.1.12.2 HIP1-Plasmide 76
4.2.1.12.2.1 pTL1-HIP1 (218-604) 76
4.2.1.12.2.2 pGEX-HIP1 (218-604) 76
4.2.1.12.2.3 pGEX-6P-1-HIP1, pQE32-HIP1 und pTL1-HA3-HIP1 (1-1003), (1-604), (1-333), (1-217), (218-604) und (334-604)
 76
4.2.1.12.3 pGEX-a-Adaptin 77
4.2.1.12.4 pSE111 Helferplasmid für Proteinexpression 77
4.2.2 Grundlegende mikrobiologische Methoden 78
4.2.2.1 Herstellung elektrokompetenter Zellen 78
4.2.2.2 Transformation kompetenter Bakterien mittels Elektroporation 78
4.2.2.3 Kultivierung und Lagerung von transformierten Bakterien 79
4.2.3 Grundlegende proteinbiochemische Methoden 79
4.2.3.1 Expression von rekombinanten GST-Fusionsproteinen in E. coli 79
4.2.3.2 Reinigung von rekombinanten GST-Fusionsproteinen 80
4.2.3.3 Reinigung von rekombinanten His-Fusionsproteinen unter nativen Bedingungen
 80
4.2.3.4 Reinigung von rekombinanten His-Fusionsproteinen unter denaturierenden Bedingungen
 81
4.2.3.5 Konzentrationsbestimmung von Proteinlösungen 82
4.2.3.6 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 82
4.2.3.7 Coomassie-Färbung von SDS-Gelen 83
4.2.3.8 Western Blot 84
4.2.3.9 Filtertest 85
4.2.3.10 Proteinbindungstest und Peptidkompetitionsstudien 86
4.2.3.11 Protein Overlay-Assay 86
4.2.3.12 Aufreinigung von Clathrin-bedeckten Vesikeln 87
4.2.3.13 Immunmarkierung der Clathrin-bedeckten Vesikel für elektronenmikroskopische Untersuchungen
 87
4.2.4 Grundlegende zellbiologische Methoden 88
4.2.4.1 Auftauen von kryokonservierten Säugetierzellen 88
4.2.4.2 Kultivierung und Lagerung von Säugetierzellen 88
4.2.4.3 Trypsinieren von Säugetierzellen 89
4.2.4.4 Bestimmung der Zellkonzentration von kultivierten Säugetierzellen 89
4.2.4.5 Transfektion von Säugetierzellen 89
4.2.4.6 Herstellung der stabilen, induzierbaren Tet-Off Zellen 90
4.2.4.7 Herstellung von Zelllysaten 90
4.2.4.8 Vorbereitung von Zellpräparaten für die Immunfluoreszenzmikroskopie 91
4.2.4.9 Vorbereitung von Zellpräparaten für die Elektronenmikroskopie 92
4.2.4.10 Inhibierung des Proteasoms mit Lactacystin 93
4.2.4.11 Toxizitätstest 93
4.2.5 Grundlegende immunologische Methoden 93
4.2.5.1 Herstellung von polyklonalen Antikörpern 93
4.2.5.2 Affinitätsreinigung von polyklonalen Antikörpern 94
4.2.5.3 IgG-Präparation aus Antiserum 94
4.2.6 Massenspektrometrie 95
4.2.6.1 Aufbereitung der Gelprobe 95
4.2.6.2 MALDI-TOF-MS Probenvorbereitung und Analyse 95
5. Literaturverzeichnis 97
6. EigenePublikationen 108
7. Abkürzungen 109
8. Danksagung 112
9. Zusammenfassung 113
10. Abstract 115

More Information:

Online available: http://www.diss.fu-berlin.de/2003/41/indexe.html
Language of PhDThesis: german
Keywords: Huntington`s Disease, huntingtin, aggresome, huntingtin-interacting protein 1, endocytosis
DNB-Sachgruppe: 32 Biologie
Date of disputation: 13-Aug-2002
PhDThesis from: Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie, Freie Universität Berlin
First Referee: Prof. Dr. Erich E. Wanker
Second Referee: Prof. Dr. Werner Reutter
Contact (Author): s.waelter@mdc-berlin.de
Contact (Advisor): ewanker@mdc-berlin.de
Date created:14-Feb-2003
Date available:24-Feb-2003

 

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