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FU Berlin
Digitale Dissertation

Uwe Müller :
Makromolekulare Kristallographie bei atomarer Auflösung:Synthetische Nukleinsäurefragmente und bakterielle Kälteschockproteine
Macromolecular Crystallography at Atomic Resolution: Synthetic Nucleic acid fragments and bacterial Cold-shock proteins

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|Zusammenfassung| |Inhaltsverzeichnis| |Ergänzende Angaben|

Zusammenfassung

Kristallstrukturanalyse von ALAwt und ALAC70
Die Haupterkennungssignale für die spezifische Erkennung der tRNAAla aus E. coli durch die AlaRS sind im Akzeptorstamm dieses Moleküls lokalisiert. Ein über alle Lebensformen konserviertes G3*U70-Basenpaar stellt hierbei das Haupterkennungselement dar. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Strukturanalyse des heptameren Akzeptorstamms ALAwt und der inaktiven C70-Mutante, ALAC70, sollte Hinweise über die strukturelle Basis dieser Erkennungsmechanismen von der Seite der RNA geben. Daneben sollte diese Studie einen Einblick in das strukturelle Verhalten und die Auswirkungen eines G*U "wobble"-Basenpaars innerhalb eines Watson-Crick -gepaarten Doppelstrangs geben.

Kristallstrukturanalyse eines 3´-DNA-RNA-5´ Hybrids aus HIV-I
Das chimäre Oktamer HIVChi dient als Modell für die Beschreibung der 3´-DNA-RNA-5´ Verknüpfung, welches bei der Initiation der Minus-Strang-Synthese der HIV-Replikation gebildet wird. HIVChi kristallisiert mit zwei identischen Oktamerduplexen in der asymmetrischen Einheit. Beide Moleküle liegen in der A-Konformation vor. Dies beinhaltet eine C3´-endo Zuckerwellung für alle 32 Ribosen bzw. Desoxyribosen. Der Vergleich der tetrameren RNA-RNA- sowie RNA-DNA-Duplexhälften, sowie die Analyse des Übergangsbereichs ergab keine signifikanten Unterschiede, die durch die Basenpaarung von RNA mit DNA-Nukleotiden erklärt werden könnte. Die sequenzabhängige Analyse der Helixparameter ergab eine geringe Korrelation beim Vergleich der beiden Kopien.

Kristallstrukturanalyse von Bc-Csp und der Bc-CspR3E-Mutante
Die Kristallstrukturen des Kälteschockproteins Bc-Csp aus Bacillus caldolyticus und seiner R3E-Mutante konnten bei atomarer Auflösung mit einer großen Genauigkeit bestimmt werden. Beide Proteine kristallisieren isomorph in der tetragonalen Raumgruppe I41 mit zwei Proteinmolekülen in der asymmetrischen Einheit. Diese bilden Homodimere aus, deren Struktur sich von der Dimerstruktur des Kälteschockproteins CspB aus Bacillus subtilis unterscheidet. Die dreidimensionale Struktur des Bc-Csp Monomers entspricht nahezu der von CspB. Es konnten lediglich geringfügige Abweichungen des Hauptkettenverlaufs innerhalb flexibler Schleifenbereiche identifiziert werden. Diese Abweichungen konnten teilweise bezüglich einer erhöhten Stabilität der Polypeptidkette durch zusätzliche Wechselwirkungen bei Bc-Csp interpretiert werden. Die spezifische Bindung eines Na+-Kations im Bereich von Schleife 2 stabilisiert die beta-Faltblattstruktur zwischen Strang beta2-beta3. Von besonderem Interesse ist die Analyse des Bereichs der E3R- und A46E-Mutationen beim Übergang vom mesophilen zum thermophilen Protein. Bc-Csp ist in der Lage, eine stabilisierende Salzbrücke zwischen R3 und E46 unter zusätzlicher Stabilisierung durch den Rest K5 auszubilden. Der Verlust der solvenzexponierten R3-E46 Salzbrücke kann den Verlust an Thermostabilität alleine nicht erklären.

Inhaltsverzeichnis

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Titelseite und Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
1.0. Die Bedeutung der Auflösung bei Kristallstrukturanalysen
1.1. Der Akzeptorstamm der tRNAAla aus Escherichia coli
1.2. DNA-RNA Hybridstrukturen im Replikationszyklus des HIV-Virus
1.3. Das Kälteschockprotein Bc-Csp aus Bacillus caldolyticus

2. Materialien und Methoden
2.1. Hybridisierung und Reinigung der Nukleinsäuren
2.2. Kristallisation der Nukleinsäuren
2.3. Kristallisation von Bc-Cspund Bc-CspR3E
2.4. Das Diffraktionsexperiment
2.5. Die Methode des Isomorphen Ersatzes der tRNAAla-Helix
2.6. Die Methode des Molekularen Ersatzes bei HIVChi und Bc-Csp
2.7. Detektion und Dekonvolution von Fehlordungsstrukturen
2.8. Strukturverfeinerung von HIVChi mit XPLOR-V3.8
2.9. Verfeinerung von ALAwt, ALAC70 und Bc-Csp mit SHELXL-97

3. Ergebnisse und Diskussion
3.1. Kristallstrukturanalyse von ALAwt und ALAC70
3.2. Kristallstrukturanalyse eines 3´-DNA-RNA-5´-hybrids aus HIV-I
3.3. Kristallstrukturanalyse von Bc-Csp und der Bc-CspR3E-Mutante
3.4. Besonderheiten der Kristallstrukturanalyse biologischer Makromoleküle bei atomarer Auflösung

4. Zusammenfassung
4.1. Kristallstrukturanalyse von ALAwt und ALAC70
4.2. Kristallstrukturanalyse eines 3´-DNA-RNA-5´ Hybrids aus HIV-I
4.3. Kristallstrukturanalyse von Bc-Csp und der Bc-CspR3E-Mutante

5. Summary
5.1. Crystal Structure of ALAwt and ALAC70
5.2. Crystal Structure of a 3´-DNA-RNA-5´ Hybrid from HIV-1
5.3. Crystal Structure of Bc-Csp and the Bc-CspR3E mutant

6. Literaturverzeichnis
6.1. Publikationsliste

7. Anhang
7.1. Abbildungsverzeichnis
7.2. Tabellenverzeichnis
7.3. Nukleinsäurebausteine
7.4. Standard-Aminosäuren

Danksagung
Curriculum Vitae
Eidesstattliche Erklärung

Ergänzende Angaben:

Online-Adresse: http://www.diss.fu-berlin.de/1999/38/index.html
Sprache: Deutsch
Keywords: nucleic acid and protein structure
DNB-Sachgruppe: 30 Chemie
Datum der Disputation: 28-Jun-99
Entstanden am: Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie, Freie Universität Berlin
Erster Gutachter: Prof. Dr. Udo Heinemann
Zweiter Gutachter: Prof. Dr. Hans Hartl
Kontakt (Verfasser): umue@mdc-berlin.de
Kontakt (Betreuer): heinemann@mdc-berlin.de
Abgabedatum:29-Jun-99
Freigabedatum:07-Jul-99

 

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