FU Berlin Digitale Dissertation
Markus Kalkum : Massenspektrometrische Methoden für die biochemische Proteomforschung: Identität, Primärstruktur und Prozessierung funktioneller Proteine der bakteriellen Konjugation. Mass Spectrometric Methods for Biochemical Proteome Research: Identity, Primary Structure and Processing of Proteins Functionally Involved in Bacterial Conjugation.
|Zusammenfassung| |Inhaltsverzeichnis| |Ergänzende Angaben|

Zusammenfassung In dieser Arbeit werden erstmals systematische Untersuchungen zur geordneten Übertragung von Substanzen auf MALDI-MS Probenträger mit einem, aus mehreren piezoelektrischen Mikrodispensern bestehenden, Robotersystem vorgestellt. Bei Anwendung dieses Mikrodispensierverfahrens müssen nur noch Femtomole an Abbaupeptiden in das Massenspektrometer überführt werden, um die zugrundeliegenden Proteine anhand der Peptidmassen verläßlich zu identifizieren. Dies sind ~ 1 % der bisher benötigten Menge. Zusammen mit dem hier vorgestellten, patentierten, elektroakustischen Mikrotropfendetektionssystem (HARP) lassen sich MALDI-MS-Probenträger mit sehr hoher Probendichte herstellen, die dann vollautomatisch gemessen werden. Algorithmen zur automatischen Auswertung von MALDI-MS Spektren wurden erstellt und angewendet. Die Identität funktioneller Proteine des DNA-Transferapparates der bakteriellen Konjugation wurde nach ein- und zweidimensionaler gelelektrophoretischer Trennung, sowie nach Immobilisierung auf Membranen, durch massenspektrometrische Bestimmung der Abbaupeptide belegt. Primärstruktur und komplexchemische Analysen beweisen u.a. daß der Relaxosomenbestandteil, TraH, ein eisenkomplexierendes und das "entry exclusion" vermittelnde TrbK ein Lipo- Protein ist. Außerdem wurde die Abspaltung des bisher nur postulierten Signalpeptids von TrbM bestätigt. Im nichtinduzierten Zustand werden in E. coli Lac-I, TrbG, TraL, TrbJ und TrbM als die am stärksten exprimierten, plasmidkodierten Proteine nachgewiesen. MALDI-MS Analysen mit Proben ganzer Zellen wurden zur Identifizierung der Hauptkomponente des extrazellulären Pilus optimiert. Mit der üblicher Weise für synthetische Polymere genutzten MALDI-MS Matrix trans-3-Indolylacrylsäure läßt sich das Genprodukt von trbC als Pilushauptkomponente in bisher unerreichter Empfindlichkeit detektieren. Das von RP4 kodierte, in Escherichia coli ribosomal synthetisierte, Pilin wird nach mehrfacher Prozessierung von TraF zu einem 78 Aminosäuren großen zyklischen Molekül umgewandelt. Die ehemaligen N- und C-Termini werden dabei über eine Peptidbindung miteinander verknüpft. Das resultierende Zykloprotein stellt das derzeit weltweit größte bekannte zyklische Polypeptid dar. Das vom Schwesterplasmid R751 kodierte TrbC, sowie das virB2-Genprodukt von Agrobacterium tumefaciens hat eine analoge zyklische Primärstruktur. Eine Kombination aus Mutageneseexperimenten und der MALDI-MS Analyse kompletter Zellpräparationen erweitert die Vorstellung über einen möglichen molekularen Zyklisierungsmechanismus: Im periplasmatischen Raum spaltet die Serinprotease TraF ein 4 Aminosäure langes Peptid vom C-Terminus des TrbCs ab. Es wird postuliert, daß sich das resultierende Acyl-Enzym durch Aminolyse mit der a -Aminogruppe von TrbC in zyklisches TrbC* und in wiederhergestelltes TraF aufspaltet. >> s. auch: ausführliche Zusammenfassung im PDF-Format

Inhaltsverzeichnis Die gesamte Dissertation können Sie als gezippten tar-File oder als zip-File laden. Durch Anklicken der Kapitelüberschriften können Sie das Kapitel in PDF-Format laden: Titel und detailliertes Inhaltsverzeichnis Seite 1. EINLEITUNG 1 1.1. DIE MASSENSPEKTROMETRIE IN DER PROTEOMFORSCHUNG 1 1.2. HORIZONTALER GENTRANSFER DURCH BAKTERIELLE KONJUGATION 7 2. MATERIALIEN UND METHODEN 13 2.1. VERWENDETE MATERIALIEN UND DEREN BEZUGSQUELLEN 13 2.2. MIKRODISPENSIERTECHNIK ZUR AUTOMATISCHEN MALDI-MS PROBENPRÄPARATION 15 2.3. ELEKTROAKUSTISCHES VERFAHREN ZUR EXAKTEN POSITIONIERUNG VON MEHRFACH- MIKRODISPENSEREINHEITEN (HARP) 18 2.4. BIOANALYTISCHE METHODEN 25 2.5. MASSENSPEKTROMETRIE 28 2.6. PROGRAMMIERUNG UND SOFTWARE 31 3. ERGEBNISSE 32 3.1. MINIATURISIERUNG UND AUTOMATISIERUNG DER PROBENPRÄPARATION FÜR DIE MATRIX- ASSISTIERTE LASER DESORPTIONS / IONISATIONS MASSENSPEKTROMETRIE (MALDI-MS) 32 3.2. IDENTIFIZIERUNG RP4-KODIERTER PROTEINE AUS VERGLEICHENDER ZWEIDIMENSIONALER GELELEKTROPHORETISCHER TRENNUNG 43 3.3. DER WEG ZUR AUTOMATISCHEN MALDI-MS AUSWERTUNG 52 3.4. DIE POSTTRANSLATIONALEN MODIFIZIEUNGEN DER GENPRODUKTE VON TRAH UND TRBK 56 3.5. MALDI-MS VOLLSTÄNDIGER ZELLEN UND ZELLÜBERSTÄNDE ZUR ANALYSE DER HAUPTPROTEINKOMPONENTEN KONJUGATIVER PILI. 62 4. DISKUSSION 82 4.1. AUTOMATISIERUNG PIEZOELEKTRISCHER MIKRODISPENSIERTECHNIKEN 82 4.2. NICHTINDUZIERTE EXPRESSION VON TRA2 UND TRA1 PROTEINEN 84 4.3. DIE BESTIMMUNG DER PROTEINHAUPTKOMPONENTEN KONJUGATIVER PILI VON RP4, R751 UND TI 89 5. ZUSAMMENFASSUNG 97 6. SUMMARY 98 7. BIBLIOGRAPHISCHER NACHWEIS 99 CURRICULUM VITAE 108

Ergänzende Angaben:
Online-Adresse:	http://www.diss.fu-berlin.de/1999/44/index.html
Sprache:	Deutsch
Keywords:	mass spectrometry, MALDI-MS, automation, cyclic pilin, bacterial conjugation, proteome research
DNB-Sachgruppe:	30 Chemie
Datum der Disputation:	01-Jun-1999
Entstanden am:	Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie, Freie Universität Berlin
Erster Gutachter:	Prof. Dr. Hans Lehrach
Zweiter Gutachter:	Prof. Dr. Walter Messer
Kontakt (Verfasser):	kalkum@mpimg-berlin-dahlem.mpg.de
Kontakt (Betreuer):	lehrach@mpimg-berlin-dahlem.mpg.de
Abgabedatum:	19-Jul-1999
Freigabedatum:	24-Aug-2000

 

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