FU Berlin Digitale Dissertation
Matthias Budt : Charakterisierung der Expression und Signaltransduktion des Zelladhäsionsmoleküls CEACAM1 in PC12-Zellen Characterisation of expression and signal transduction of the cell adhesion molecule CEACAM1 in PC12 cells
|Zusammenfassung| |Inhaltsverzeichnis| |Ergänzende Angaben|

Zusammenfassung CEACAM1-Isoformen In PC12-Zellen der Ratte wurden die Spleißvarianten CEACAM1-4L und CEACAM1-4S nachgewiesen. Zusätzlich wurden zwei neue Isoformen, CEACAM1-4C1 und CEACAM1-4C2, identifiziert. Beide Formen sind sekretierte Proteine. Das CEACAM1-4C2 weist einen zu CEACAM1-4L identischen C-Terminus auf. Mittels eines Antiserums gegen die zytoplasmatische Domäne von CEACAM1-4L konnte CEACAM1-4C2 deshalb auf Proteinebene sowohl in vitro in konditioniertem Medium von PC12-Zellen als auch in vivo in Rattenserum nachgewiesen werden. Im Serum von Hepatom-tragenden Tieren war CEACAM1-4C2 verstärkt nachzuweisen. Signaltransduktion des CEACAM1 Die CEACAM1-Tyrosinphosphorylierung konnte nach Inhibition zellulärer Tyrosinphos-phatasen mit dem Phosphataseinhibitor Pervanadat dargestellt werden. Die Modulation der makromolekularen Organisation des CEACAM1 durch Gabe von Antikörpern wurde angewendet, um einen CEACAM1-spezifischen Reiz zu erzeugen. Die Stimulation mit dem anti-CEACAM1 mAk Be 9.2 in Kombination mit einem sekundären Antikörper bewirkte dabei die Erzeugung großer CEACAM1-Cluster in der Plasmamembran. Die Stimulation von CEACAM1 durch Clustern hatte seine schnelle und reversible Tyrosin-Dephosphorylierung zur Folge. Eine direkte Auswirkung dieser Dephosphorylierung bestand in der Modulation der Bindung der Tyrosinphosphatase SHP2 an CEACAM1: Diese Interaktion war von der CEACAM1-Tyrosinphosphorylierung abhängig und wurde deshalb nach Stimulation verringert. Das an der Membran initiierte Signal bewirkte im Zytoplasma die temporäre und spezifische Aktivierung der MAP-Kinasen ERK1 und ERK2. Die verwandten MAP-Kinasen JNK und p38 wurden dagegen nicht aktiviert. Nach der durch NGF induzierten neuronalen Differenzierung der PC12-Zellen war das konstitutive Niveau der CEACAM1-Tyrosinphosphorylierung reduziert und die Stimulation von CEACAM1 führte nicht mehr zu einer weiteren Dephosphorylierung. Die Interaktion von CEACAM1 mit dem Aktin-Zytoskelett Die Stimulation des CEACAM1 durch Clustern bewirkte seine Bindung an das Aktin-Zytoskelett. Es wurde ein Versuchssystem etabliert, bei dem die Extrahierbarkeit von CEACAM1 aus Zellen mit Detergens Triton X-100 als Maß für die Interaktion mit dem Aktin-Kortex diente. Die F-Aktin-destabilisierenden Reagenzien Cytochalasin D und Latrunculin A konnten die Cluster-induzierte Unlöslichkeit des CEACAM1 deutlich verringern. Die CEACAM1-Aktin-Interaktion war abhängig vom Zustand der Zellen: Sowohl die Erhöhung der Zelldichte als auch die neuronale Differenzierung der PC12-Zellen bewirkte eine verstärkte Interaktion. Die CEACAM1-Tyrosinphosphorylierung hatte keinen Einfluß auf seine Bindung an Aktin, umgekehrt aber war ein intaktes Zytoskelett für die Regulation der CEACAM1-Tyrosinphosphorylierung von Bedeutung. Der zytoplasmatische Teil des CEACAM1 war nicht nötig für die Cluster-induzierte Bindung an das Aktin-Zytoskelett, wie durch Verwendung der Mutante CEACAM1-DC ohne zytoplasmatischen Teil gezeigt wurde. Die Kolokalisation von CEACAM1 und Aktin an Zellkontakten in Barbe-Endothelzelen war dagegen nur für CEACAM1-4L nachweisbar.

Inhaltsverzeichnis Die gesamte Dissertation können Sie als gezippten tar-File oder als zip-File laden. Durch Anklicken der Kapitelüberschriften können Sie das Kapitel in PDF-Format laden: 0. Titelblatt 1. Einleitung 4 1.1. Die Zelladhäsion 4 1.2. Das Carcinoembryonale Antigen (CEA) und die CEA-Familie 9 1.3. CEACAM1: Struktur und Expression 12 1.4. Funktionen des CEACAM1 14 1.4.1. Zelladhäsion 14 1.4.2. Rezeptor für Bakterien und Viren 15 1.4.3. Tumorsuppression 16 1.4.4. Regulation der Zellproliferation und der Differenzierung 16 1.5. Signaltransduktion 19 1.5.1. Signaltransduktion des CEACAM1 20 1.6. Das Zytoskelett 23 1.7. Zielsetzung 26 2. Ergebnisse 27 2.1. CEACAM1-Isoformen in PC12-Zellen 27 2.1.1. Transmembranäre Isoformen 27 2.1.2. Sekretierte Isoformen 29 2.2. CEACAM1-Tyrosinphosphorylierung 34 2.2.1. Stimulation von CEACAM1 induziert dessen Tyrosin-Dephosphorylierung 36 2.3. CEACAM1 bindet die Tyrosinphosphatase SHP2 38 2.4. CEACAM1-Stimulation aktiviert die Mitogen-aktivierten Protein-Kinasen (MAPK) ERK1 und ERK2 39 2.5. Clustern induziert die Bindung von CEACAM1 an das Aktin-Zytoskelett 41 2.5.1. CEACAM1 wird durch Quervernetzen nicht in Lipid-Rafts oder Endosomen rekrutiert 44 2.5.2. Modulation der CEACAM1-Aktin-Interaktion 46 2.5.3. Die Rolle der zytoplasmatischen Domäne des CEACAM1 bei der Cluster-induzierten Interaktion mit dem Aktin-Zytoskelett 47 2.5.4. Interaktion von CEACAM1-L und Aktin in Detergens-resistenten Strukturen an Zellkontakten in Rattenhirn-Endothel-Zellen 48 2.6. Funktionelle Hierarchie der Cluster-induzierten Effekte am CEACAM1 50 2.7. Einfluß der neuronalen Differenzierung der PC12-Zellen auf die CEACAM1-Stimulation 53 3. Diskussion 56 3.1. CEACAM1-Expression in PC12-Zellen 56 3.1.1. Transmembranäre CEACAM1-Isoformen 56 3.1.2. Neue sekretierte CEACAM1-Isoformen 57 3.2. CEACAM1-Tyrosinphosphorylierung und ?Signaltransduktion 60 3.3. Die Interaktion von CEACAM1 mit dem Aktin-Zytoskelett 68 3.4. Einfluss der neuronalen Differenzierung auf die CEACAM1-Stimulation 72 3.5. Ausblick 73 4. Zusammenfassung 75 4.1. CEACAM1-Isoformen 75 4.2. Signaltransduktion des CEACAM1 75 4.3. Die Interaktion von CEACAM1 mit dem Aktin-Zytoskelett 76 4. Summary 77 4.1. CEACAM1 Isoforms 77 4.2. CEACAM1-mediated Signal Transduction 77 4.3. Interaction of CEACAM1 with the Actin Cytoskeleton 78 5. Material und Methoden 79 5.1. Material 79 5.1.1. Zelllinien 79 5.1.2. Bakterien 79 5.1.3. Plasmide 79 5.1.4. Primer 79 5.1.5. Antikörper, Marker, Kits, Chemikalien 80 5.1.6. Enzyme 81 5.1.7. Nährmedien 82 5.1.8. Chemikalien 83 5.1.9. Lösungen 83 5.1.10. Geräte 87 5.2. Methoden 88 5.2.1. Zellbiologische Methoden 88 5.2.1.1. Kultivierung von Zellen 88 5.2.1.2. Auftauen und Einfrieren von Zelllinien 88 5.2.1.3. Stimulation von Zellen 88 5.2.1.4. Herstellung von Natriumorthovanadat- und -Pervanadat -Lösung 89 5.2.1.5. Solubilisierung von Zellen 89 5.2.1.6. Quantifizierung der Detergenslöslichkeit von CEACAM1 89 5.2.1.7. Quantifizierung der CEACAM1-Tyrosinphosphorylierung 89 5.2.1.8. Transfektion von DNA in Eukaryonten-Zellen 90 5.2.2. Proteinchemische Methoden 90 5.2.2.1. Proteinbestimmung 90 5.2.2.2. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 90 5.2.2.3. Coomassie-Färbung von Proteingelen 91 5.2.2.4. Silberfärbung von Proteingelen 91 5.2.2.5. Western-Blotting 91 5.2.2.6. Dichtegradientenzentrifugation zu Isolierung von Lipid-Rafts 91 5.2.3. Immunchemische Methoden 92 5.2.3.1. Reinigung von Antikörpern durch Affinitätschromatographie 92 5.2.3.2. Immunblot 92 5.2.3.3. Immunpräzipitation 93 5.2.3.4. FACS-Analyse 93 5.2.3.5. Immunfluoreszenzfärbung und konfokale Laser-Scanning Mikroskopie 93 5.2.4. Mikrobiologische Methoden 94 5.2.4.1. Kultivierung von E. coli 94 5.2.4.2. Herstellung kompetenter Bakterien 94 5.2.5. Molekularbiologische Methoden 95 5.2.5.1. RNA-Präparation 95 5.2.5.2. cDNA-Synthese 95 5.2.5.3. Polymerasekettenreaktion (PCR) 95 5.2.5.4. Agarose-Gelelektrophorese 95 5.2.5.5. Isolierung von DNA-Fragmenten mittels Gelelution 95 5.2.5.6. Klonierung und Ligation von PCR-Produkten 96 5.2.5.7. Transformation von Plasmid-DNA in E. coli 97 5.2.5.8. Plasmid-Schnell-Präparation 97 5.2.5.9. Midi- und Maxi-Plasmidpräparationen 97 5.2.5.10. Spaltung von DNA durch Restriktiosendonuklesaen 98 5.2.5.11. Sequenzierung 98 6. Literatur 99 7. Anhang 126 Abkkürzungen 126 Veröffentlichungen 128 Lebenslauf 130 Danksagung 131

Ergänzende Angaben:
Online-Adresse:	http://www.diss.fu-berlin.de/2002/101/index.html
Sprache:	Deutsch
Keywords:	CEACAM1, signal transduction, phosphorylation, actin cytoskeleton,
DNB-Sachgruppe:	32 Biologie
Datum der Disputation:	11-Jun-2002
Entstanden am:	Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie, Freie Universität Berlin
Erster Gutachter:	Prof. Dr. Werner Reutter
Zweiter Gutachter:	Prof. Dr. Ralf Erdmann
Kontakt (Verfasser):	budt@zedat.fu-berlin.de
Kontakt (Betreuer):	reutter@medizin.fu-berlin.de
Abgabedatum:	18-Jun-2002
Freigabedatum:	19-Jun-2002

 

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