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FU Berlin
Digitale Dissertation

Matthias Budt :
Characterisation of expression and signal transduction of the cell adhesion molecule CEACAM1 in PC12 cells
Charakterisierung der Expression und Signaltransduktion des Zelladhäsionsmoleküls CEACAM1 in PC12-Zellen

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Abstract

CEACAM1-Isoforms In rat PC12 cells, the CEACAM1-4L and CEACAM1-4S splice variants were detected. Additionally, two novel isoforms, CEACAM1-4C1 and CEACAM1-4C2 were identified. Both are secreted proteins. The C-terminus of CEACAM1-4C2 is identical to that of CEACAM1-4L, which allowed the specific detection of CEACAM1-4C2 on the protein level by an antiserum directed against the CEACAM1-4L cytoplasmic part. CEACAM1-4C2 was found both in vitro in conditioned cell culture medium from PC12 cells and in vivo in rat serum. In serum of animals with a growing Morris hepatoma, the CEACAM1-4C2 level was elevated. CEACAM1-mediated Signal Transduction CEACAM1 tyrosine phosphorylation was detectable after inhibition of cellular tyrosine phosphatases with the phosphatase inhibitor pervanadate. The modulation of CEACAM1 macromolecular organisation by addition of antibodies was applied in order to induce a CEACAM1-specific stimulus. Treatment with the anti-CEACAM1 mAb Be 9.2 in combination with a secondary antibody caused the formation of large CEACAM1-clusters in the plasma membrane. Stimulation of CEACAM1 by clustering induced its fast and reversible tyrosine dephosphorylation. The interaction of CEACAM1 with the tyrosine phosphatase SHP2 was directly influenced by this dephosphorylation: the interaction, which is dependent on CEACAM1 tyrosine phosphorylation, was reduced after stimulation. The signal initiated at the membrane caused the reversible and specific activation of the MAP kinases ERK1 und ERK2. In contrast, the activity of the related kinases JNK and p38 remained unchanged. Neuronal differentiation of PC12 cells with NGF reduced the constitutive level of CEACAM1 tyrosine phosphorylation and abolished further dephosphorylation upon stimulation of CEACAM1. Interaction of CEACAM1 with the Actin Cytoskeleton Stimulation by clustering caused CEACAM1 to bind to the actin cytoskeleton. An assay was established, in which the degree of insolubility of CEACAM1 after extraction of cells with the detergent Triton X-100 was calculated as a measure for its interaction with the actin cortex. The F-actin-destabilizing reagents cytochalasin D and latrunculin A significantly reduced the level of clustering-induced CEACAM1 detergent insolubility. The CEACAM1-actin-interaction was dependent on several aspects of the cellular state: both an increase in cell density as well as neuronal differentiation of PC12 cells induced a stronger interaction. The level of CEACAM1 tyrosine phosphorylation had no influence on its interaction with actin. Contrary, an intact cytoskeleton was important for the regulation of CEACAM1 tyrosine phosphorylation. The cytoplasmic part of CEACAM1 was dispensable for the clustering-induced binding to the actin cytoskeleton, demonstrated with a deletion mutant lacking the cytoplasmic tail. Adversly, the colocalization of CEACAM1 and actin at cell contacts in Barbe endothelial cells was only detected for CEACAM1-4L.

Table of Contents

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0. Titelblatt

1. Einleitung 4

1.1. Die Zelladhäsion 4

1.2. Das Carcinoembryonale Antigen (CEA) und die CEA-Familie 9

1.3. CEACAM1: Struktur und Expression 12

1.4. Funktionen des CEACAM1 14

1.4.1. Zelladhäsion 14

1.4.2. Rezeptor für Bakterien und Viren 15

1.4.3. Tumorsuppression 16

1.4.4. Regulation der Zellproliferation und der Differenzierung 16

1.5. Signaltransduktion 19

1.5.1. Signaltransduktion des CEACAM1 20

1.6. Das Zytoskelett 23

1.7. Zielsetzung 26

2. Ergebnisse 27

2.1. CEACAM1-Isoformen in PC12-Zellen 27

2.1.1. Transmembranäre Isoformen 27

2.1.2. Sekretierte Isoformen 29

2.2. CEACAM1-Tyrosinphosphorylierung 34

2.2.1. Stimulation von CEACAM1 induziert dessen Tyrosin-Dephosphorylierung 36

2.3. CEACAM1 bindet die Tyrosinphosphatase SHP2 38

2.4. CEACAM1-Stimulation aktiviert die Mitogen-aktivierten Protein-Kinasen (MAPK) ERK1 und ERK2 39

2.5. Clustern induziert die Bindung von CEACAM1 an das Aktin-Zytoskelett 41

2.5.1. CEACAM1 wird durch Quervernetzen nicht in Lipid-Rafts oder Endosomen rekrutiert 44

2.5.2. Modulation der CEACAM1-Aktin-Interaktion 46

2.5.3. Die Rolle der zytoplasmatischen Domäne des CEACAM1 bei der

Cluster-induzierten Interaktion mit dem Aktin-Zytoskelett 47

2.5.4. Interaktion von CEACAM1-L und Aktin in Detergens-resistenten

Strukturen an Zellkontakten in Rattenhirn-Endothel-Zellen 48

2.6. Funktionelle Hierarchie der Cluster-induzierten Effekte am CEACAM1 50

2.7. Einfluß der neuronalen Differenzierung der PC12-Zellen auf die CEACAM1-Stimulation 53

3. Diskussion 56

3.1. CEACAM1-Expression in PC12-Zellen 56

3.1.1. Transmembranäre CEACAM1-Isoformen 56

3.1.2. Neue sekretierte CEACAM1-Isoformen 57

3.2. CEACAM1-Tyrosinphosphorylierung und ?Signaltransduktion 60

3.3. Die Interaktion von CEACAM1 mit dem Aktin-Zytoskelett 68

3.4. Einfluss der neuronalen Differenzierung auf die CEACAM1-Stimulation 72

3.5. Ausblick 73

4. Zusammenfassung 75

4.1. CEACAM1-Isoformen 75

4.2. Signaltransduktion des CEACAM1 75

4.3. Die Interaktion von CEACAM1 mit dem Aktin-Zytoskelett 76

4. Summary 77

4.1. CEACAM1 Isoforms 77

4.2. CEACAM1-mediated Signal Transduction 77

4.3. Interaction of CEACAM1 with the Actin Cytoskeleton 78

5. Material und Methoden 79

5.1. Material 79

5.1.1. Zelllinien 79

5.1.2. Bakterien 79

5.1.3. Plasmide 79

5.1.4. Primer 79

5.1.5. Antikörper, Marker, Kits, Chemikalien 80

5.1.6. Enzyme 81

5.1.7. Nährmedien 82

5.1.8. Chemikalien 83

5.1.9. Lösungen 83

5.1.10. Geräte 87

5.2. Methoden 88

5.2.1. Zellbiologische Methoden 88

5.2.1.1. Kultivierung von Zellen 88

5.2.1.2. Auftauen und Einfrieren von Zelllinien 88

5.2.1.3. Stimulation von Zellen 88

5.2.1.4. Herstellung von Natriumorthovanadat- und -Pervanadat -Lösung 89

5.2.1.5. Solubilisierung von Zellen 89

5.2.1.6. Quantifizierung der Detergenslöslichkeit von CEACAM1 89

5.2.1.7. Quantifizierung der CEACAM1-Tyrosinphosphorylierung 89

5.2.1.8. Transfektion von DNA in Eukaryonten-Zellen 90

5.2.2. Proteinchemische Methoden 90

5.2.2.1. Proteinbestimmung 90

5.2.2.2. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 90

5.2.2.3. Coomassie-Färbung von Proteingelen 91

5.2.2.4. Silberfärbung von Proteingelen 91

5.2.2.5. Western-Blotting 91

5.2.2.6. Dichtegradientenzentrifugation zu Isolierung von Lipid-Rafts 91

5.2.3. Immunchemische Methoden 92

5.2.3.1. Reinigung von Antikörpern durch Affinitätschromatographie 92

5.2.3.2. Immunblot 92

5.2.3.3. Immunpräzipitation 93

5.2.3.4. FACS-Analyse 93

5.2.3.5. Immunfluoreszenzfärbung und konfokale Laser-Scanning Mikroskopie 93

5.2.4. Mikrobiologische Methoden 94

5.2.4.1. Kultivierung von E. coli 94

5.2.4.2. Herstellung kompetenter Bakterien 94

5.2.5. Molekularbiologische Methoden 95

5.2.5.1. RNA-Präparation 95

5.2.5.2. cDNA-Synthese 95

5.2.5.3. Polymerasekettenreaktion (PCR) 95

5.2.5.4. Agarose-Gelelektrophorese 95

5.2.5.5. Isolierung von DNA-Fragmenten mittels Gelelution 95

5.2.5.6. Klonierung und Ligation von PCR-Produkten 96

5.2.5.7. Transformation von Plasmid-DNA in E. coli 97

5.2.5.8. Plasmid-Schnell-Präparation 97

5.2.5.9. Midi- und Maxi-Plasmidpräparationen 97

5.2.5.10. Spaltung von DNA durch Restriktiosendonuklesaen 98

5.2.5.11. Sequenzierung 98

6. Literatur 99

7. Anhang 126

Abkkürzungen 126

Veröffentlichungen 128

Lebenslauf 130

Danksagung 131

More Information:

Online available: http://www.diss.fu-berlin.de/2002/101/indexe.html
Language of PhDThesis: german
Keywords: CEACAM1, signal transduction, phosphorylation, actin cytoskeleton,
DNB-Sachgruppe: 32 Biologie
Date of disputation: 11-Jun-2002
PhDThesis from: Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie, Freie Universität Berlin
First Referee: Prof. Dr. Werner Reutter
Second Referee: Prof. Dr. Ralf Erdmann
Contact (Author): budt@zedat.fu-berlin.de
Contact (Advisor): reutter@medizin.fu-berlin.de
Date created:18-Jun-2002
Date available:19-Jun-2002

 

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