FU Berlin Digitale Dissertation
Tim Hucho : Der Neurotrophinrezeptor p75NTR Eine biochemische Untersuchung The neurotrophin receptor p75NTR
|Zusammenfassung| |Inhaltsverzeichnis| |Ergänzende Angaben|

Zusammenfassung Neurotrophine sind Wachstumsfaktoren. In Säugern modulieren sie nicht nur weitreichende Aspekte der Entwicklung sondern auch Funktionen des erwachsenen Nervensystems. Die Signaltransduktion erfolgt einerseits über den Rezeptor p75NTR andererseits über die Rezeptor-Tyrosinkinasen TrkA, TrkB und TrkC. Während die Signalkaskaden der Trk Rezeptoren weitgehend aufgeklärt wurden, entwickelte sich das Wissen über p75NTR ebenso wie das über die verwandten Mitglieder der ?Tumor Necrosis Factor Rezeptor? (TNFR)-Superfamilie nur langsam. 10 Jahre nach der Klonierung sollten mit dieser Arbeit daher die intrazellulären Interaktoren von p75NTR identifiziert werden. Ebenso wie zur Aufklärung der Signalwege anderer Mitglieder der TNFR-Superfamilie wurden biochemische Reinigungsansätze unternommen. Sowohl die Reinigung des p75NTR-Interaktorkomplexes in Gegenwart extrazellulärer Liganden, als auch die Affinitätsreinigung über die intrazelluläre Domäne sowie die Anreicherung des p75NTR-Interaktorkomplexes in charakterisierten subzellulären Fraktionen wurde vorgenommen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zudem neue Antiseren gegen p75NTR hergestellt. Eines dieser Seren zeigte zusätzliche p75NTR-ähnliche Westernblotsignale. Überraschenderweise konnten diese Signale auch in Gehirnhomogenaten des 1992 hergestellten p75NTR-Teil-Knockout sowie in dem bis dahin nur in unserem Labor zugänglichen ersten vollständigen p75NTR-Knockout detektiert werden. Die Expression der p75NTR-ähnlichen Proteine war auf das Gehirn beschränkt, wurde postnatal stark herunterreguliert und zeigte in differenzieller Zentrifugation starke Kalziumabhängigkeit. Zusätzlich konnte in p75NTR-Knockout-Tieren eine p75NTRähnliche Bindungsstelle identifiziert werden. Die p75NTR-ähnlichen Proteine wurden gereinigt, als N-Terminus von des Mikrotubuli Assoziierten Proteins 1B (MAP1B) identifiziert und die Homologie zu p75NTR untersucht.

Inhaltsverzeichnis Die gesamte Dissertation können Sie als gezippten tar-File oder als zip-File laden. Durch Anklicken der Kapitelüberschriften können Sie das Kapitel in PDF-Format laden: 0 Titelblatt 1 1 Zusammenfassung 9 2 Abstract 10 3 Einleitung 11 3.1 Biologische Funktion der Neurotrophine 11 3.2 Struktur der Neurotrophine 13 3.3 Die Rezeptoren der Neurotrophine 14 3.3.1 Die Trk Rezeptoren 15 3.3.2 Der Neurotrophinrezeptor p75NTR 16 4 Zielsetzung der Arbeit 21 4.1 Reinigung von intrazellulären Interaktoren 21 4.1.1 Experimentelle Ansätze zur Identifikation von intrazellulären Interaktoren 21 4.2 Suche nach p75NTR-ähnlichen Molekülen 23 5 Material und Methoden 25 5.1 Material 25 5.1.1 Antikörper 25 5.1.2 Tiere 26 5.1.3 Zelllinien 26 5.1.4 Modifizierte Lambda Phosphatase 26 5.1.5 Neurotrophine 27 5.1.6 Plasmide 27 5.1.7 Medien 27 5.1.8 Adjuvantien 27 5.1.9 Chemikalien und Zubehör 28 5.1.10 Geräte 29 5.1.11 Puffer 30 5.2 Methoden 34 5.2.1 Aufreinigung intrazellulärer Interaktoren von p75NTR 34 5.2.1.1 P75NTR Konzentrationsbestimmung in Gehirnhomogenat 34 5.2.1.2 Expression und Aufreinigung des p75NTR-IZD Plasmids 34 5.2.1.3 Verwendung der BIAcore Maschine 35 5.2.1.4 Iodierung von Neurotrophinen 36 5.2.1.5 Dissoziation von Spinalganglien 37 5.2.1.6 Overlayblots 38 5.2.1.7 In vitro Translation der intrazellulären Domäne von p75NTR 38 5.2.1.8 Kopplung von 125I-Neurotrophin an p75NTR für Overlayblots 39 5.2.1.9 Bindungsstudien an dissoziierten Spinalganglien Neuronen 39 5.2.1.10 Präparation von Caveolae mit Triton X-100 40 5.2.1.11 Präparation von Caveolae mit NaCO3 40 5.2.1.12 Präparation von ?Postsynatic Densities? (PSDs) 41 5.2.2 Charakterisierung, Reinigung und Identifizierung von p75NTR-ähnlichen Proteinen 42 5.2.2.1 Herstellung polyklonaler Seren gegen die intrazelluläre Domäne von p75NTR 42 5.2.2.2 Organpräparation 42 5.2.2.3 Dephosphorylierung der FreundI Antigene 42 5.2.2.4 Bindungsassay an Spinalganglien 43 5.2.2.5 Reinigung des FreundI Antigens 43 5.2.2.6 Sequenzvergleich und Phosphorylierungsvorhersagen 44 5.2.2.7 Peptidkompetition im Westernblot 44 5.2.2.8 Präparation von Körnerzellen 45 5.2.2.9 Immunhistochemie 45 5.2.3 Vermischtes 46 5.2.3.1 NGF-ELISA 46 5.2.3.2 Herstellung einer stabilen Zelllinie 46 5.2.3.3 Biologischer Überlebensassay 47 5.2.3.4 Anzucht und Lagerung von E. coli-Bakterien 48 5.2.3.5 SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese (PAGE) 48 5.2.3.6 Semi-dry Westernblot 49 5.2.3.7 Entfernung von Antikörpern von Blotmembranen (?Strippen des Blots?) 49 5.2.3.8 Coomassie Färbung von Gelen 49 5.2.3.9 Silberfärbung von SDS-PAGE Gelen 50 5.2.3.10 Kolloidal Coomassie Färbung von SDS-PAGE Gelen 50 5.2.3.11 Konzentrationsbestimmung von Proteinen 50 6 Ergebnisse 51 6.1 Biochemischen Aufreinigung intrazellulärer Interaktoren von p75NTR 51 6.1.1 Affinitätsreinigung in Gegenwart des extrazellulären Liganden 51 6.1.2 Affinitätsreinigung über die intrazelluläre Domäne von p75NTR 52 6.1.2.1 Protein Interaktionsmessungen mit der BIAcoremaschine 52 6.1.2.2 Interaktorendetektion mit Overlayblots 55 6.1.3 Anreicherung von Interaktoren in funktionell charakterisierten, subzellulären Fraktionen 57 6.1.3.1 Präparation von Caveolae 57 6.1.3.2 Präparation von Postsynaptischen Dichten (PSDs) 58 6.2 Charakterisierung, Reinigung und Identifizierung von p75NTR-ähnlichen Proteinen 60 6.2.1 P75NTR Antiserum zeigt Westernblotsignal auch in p75NTR -/- Mäusen 60 6.2.2 FreundI Antigene sind nur im ZNS exprimiert 62 6.2.3 FreundI Antigene werden postnatal herunterreguliert 63 6.2.4 FreundI Antigen Westernblotsignal ist kalziumabhängig 63 6.2.5 FreundI Antigene wechseln die Zentrifugationsfraktion nach Inkubation 64 6.2.6 p75NTR Seren detektieren FreundI Antigene in dephosphoryliertem Gehirn- homogenat 65 6.2.7 P75NTR-ähnliche Immunfärbung in p75NTR -/- Basal Ganglien 67 6.2.8 P75NTR-ähnliche Bindung an dissoziierten Spinalganglien von p75NTR-/- Tieren 67 6.2.9 Reinigung der FreundI Antigene 68 6.2.10 Identifikation der FreundI Antigene als N-Terminus von MAP1B 73 6.2.11 Die FreundI Antigene werden von einem MAP1B Antiserum detektiert 74

Ergänzende Angaben:
Online-Adresse:	http://www.diss.fu-berlin.de/2002/115/index.html
Sprache:	Deutsch
Keywords:	neurotrophin, purification, p75, MAP1B
DNB-Sachgruppe:	30 Chemie
Datum der Disputation:	30-May-2002
Entstanden am:	Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie, Freie Universität Berlin
Erster Gutachter:	Prof. Dr. Yves-Alain Barde
Zweiter Gutachter:	Prof. Dr. Ralf Erdmann
Kontakt (Verfasser):	hucho@itsa.ucsf.edu
Kontakt (Betreuer):	yves-alain.barde@fmi.ch
Abgabedatum:	10-Jul-2002
Freigabedatum:	06-Aug-2002

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