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FU Berlin
Digitale Dissertation

Tim Hucho :
The neurotrophin receptor p75NTR
A biochemical approach
Der Neurotrophinrezeptor p75NTR

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Abstract

Neurotrophins are growth factors. In mammals, they exert a broad range of modulatory effects on developing as well as on mature neurons. Neurotrophinmediated signals are transduced by either the neurotrophin receptor p75NRT or the receptor tyrosine kinases TrkA, TrkB and TrkC. Whereas signaling via the Trkreceptors is quite well understood, even 10 years after its identification there was little known about the function and signaling pathways of p75NTR. The aim of this work was therefore to identify intracellular interactors of p75NTR. A biochemical approach was chosen, as was previously applied to related proteins of the TNFR-family. Three different purification strategies were used: 1) purification of the p75NTR-interactor complex in the presence of its extracellular ligands, 2) affinity purification via the intracellular domain of p75NTR and 3) enrichment of the p75NTR-interactor complex in characterized subcellular fractions. In addition, new antisera against p75NTR were generated and characterized. One antiserum recognized additional p75NTR-like signals on Western blot. Surprisingly, these signals remained strongly detectable in brain homogenates of a partial as well as a complete p75NTR-/- knock out mouse. The p75NTR-like antigens were expressed exclusively in the central nervous system, were strongly downregulated during postnatal development and showed calcium-dependent segregation during centrifugation. In addition, a p75NTR-like binding site was detected in dissociated dorsal root ganglia of the complete p75NTR knock out mouse. The p75NTR?like antigens were purified, identified as the N-terminus of the microtubule associated protein MAP1B and the homology to p75NTR was investigated.

Table of Contents

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0 Titelblatt 1

1 Zusammenfassung 9

2 Abstract 10

3 Einleitung 11

3.1 Biologische Funktion der Neurotrophine 11

3.2 Struktur der Neurotrophine 13

3.3 Die Rezeptoren der Neurotrophine 14

3.3.1 Die Trk Rezeptoren 15

3.3.2 Der Neurotrophinrezeptor p75NTR 16

4 Zielsetzung der Arbeit 21

4.1 Reinigung von intrazellulären Interaktoren 21

4.1.1 Experimentelle Ansätze zur Identifikation von intrazellulären Interaktoren 21

4.2 Suche nach p75NTR-ähnlichen Molekülen 23

5 Material und Methoden 25

5.1 Material 25

5.1.1 Antikörper 25

5.1.2 Tiere 26

5.1.3 Zelllinien 26

5.1.4 Modifizierte Lambda Phosphatase 26

5.1.5 Neurotrophine 27

5.1.6 Plasmide 27

5.1.7 Medien 27

5.1.8 Adjuvantien 27

5.1.9 Chemikalien und Zubehör 28

5.1.10 Geräte 29

5.1.11 Puffer 30

5.2 Methoden 34

5.2.1 Aufreinigung intrazellulärer Interaktoren von p75NTR 34

5.2.1.1 P75NTR Konzentrationsbestimmung in Gehirnhomogenat 34

5.2.1.2 Expression und Aufreinigung des p75NTR-IZD Plasmids 34

5.2.1.3 Verwendung der BIAcore Maschine 35

5.2.1.4 Iodierung von Neurotrophinen 36

5.2.1.5 Dissoziation von Spinalganglien 37

5.2.1.6 Overlayblots 38

5.2.1.7 In vitro Translation der intrazellulären Domäne von p75NTR 38

5.2.1.8 Kopplung von 125I-Neurotrophin an p75NTR für Overlayblots 39

5.2.1.9 Bindungsstudien an dissoziierten Spinalganglien Neuronen 39

5.2.1.10 Präparation von Caveolae mit Triton X-100 40

5.2.1.11 Präparation von Caveolae mit NaCO3 40

5.2.1.12 Präparation von ?Postsynatic Densities? (PSDs) 41

5.2.2 Charakterisierung, Reinigung und Identifizierung von p75NTR-ähnlichen

Proteinen 42

5.2.2.1 Herstellung polyklonaler Seren gegen die intrazelluläre Domäne von p75NTR 42

5.2.2.2 Organpräparation 42

5.2.2.3 Dephosphorylierung der FreundI Antigene 42

5.2.2.4 Bindungsassay an Spinalganglien 43

5.2.2.5 Reinigung des FreundI Antigens 43

5.2.2.6 Sequenzvergleich und Phosphorylierungsvorhersagen 44

5.2.2.7 Peptidkompetition im Westernblot 44

5.2.2.8 Präparation von Körnerzellen 45

5.2.2.9 Immunhistochemie 45

5.2.3 Vermischtes 46

5.2.3.1 NGF-ELISA 46

5.2.3.2 Herstellung einer stabilen Zelllinie 46

5.2.3.3 Biologischer Überlebensassay 47

5.2.3.4 Anzucht und Lagerung von E. coli-Bakterien 48

5.2.3.5 SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese (PAGE) 48

5.2.3.6 Semi-dry Westernblot 49

5.2.3.7 Entfernung von Antikörpern von Blotmembranen (?Strippen des Blots?) 49

5.2.3.8 Coomassie Färbung von Gelen 49

5.2.3.9 Silberfärbung von SDS-PAGE Gelen 50

5.2.3.10 Kolloidal Coomassie Färbung von SDS-PAGE Gelen 50

5.2.3.11 Konzentrationsbestimmung von Proteinen 50

6 Ergebnisse 51

6.1 Biochemischen Aufreinigung intrazellulärer Interaktoren von p75NTR 51

6.1.1 Affinitätsreinigung in Gegenwart des extrazellulären Liganden 51

6.1.2 Affinitätsreinigung über die intrazelluläre Domäne von p75NTR 52

6.1.2.1 Protein Interaktionsmessungen mit der BIAcoremaschine 52

6.1.2.2 Interaktorendetektion mit Overlayblots 55

6.1.3 Anreicherung von Interaktoren in funktionell charakterisierten, subzellulären

Fraktionen 57

6.1.3.1 Präparation von Caveolae 57

6.1.3.2 Präparation von Postsynaptischen Dichten (PSDs) 58

6.2 Charakterisierung, Reinigung und Identifizierung von p75NTR-ähnlichen

Proteinen 60

6.2.1 P75NTR Antiserum zeigt Westernblotsignal auch in p75NTR -/- Mäusen 60

6.2.2 FreundI Antigene sind nur im ZNS exprimiert 62

6.2.3 FreundI Antigene werden postnatal herunterreguliert 63

6.2.4 FreundI Antigen Westernblotsignal ist kalziumabhängig 63

6.2.5 FreundI Antigene wechseln die Zentrifugationsfraktion nach Inkubation 64

6.2.6 p75NTR Seren detektieren FreundI Antigene in dephosphoryliertem Gehirn-

homogenat 65

6.2.7 P75NTR-ähnliche Immunfärbung in p75NTR -/- Basal Ganglien 67

6.2.8 P75NTR-ähnliche Bindung an dissoziierten Spinalganglien von p75NTR-/-

Tieren 67

6.2.9 Reinigung der FreundI Antigene 68

6.2.10 Identifikation der FreundI Antigene als N-Terminus von MAP1B 73

6.2.11 Die FreundI Antigene werden von einem MAP1B Antiserum detektiert 74

More Information:

Online available: http://www.diss.fu-berlin.de/2002/115/indexe.html
Language of PhDThesis: german
Keywords: neurotrophin, purification, p75, MAP1B
DNB-Sachgruppe: 30 Chemie
Date of disputation: 30-May-2002
PhDThesis from: Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie, Freie Universität Berlin
First Referee: Prof. Dr. Yves-Alain Barde
Second Referee: Prof. Dr. Ralf Erdmann
Contact (Author): hucho@itsa.ucsf.edu
Contact (Advisor): yves-alain.barde@fmi.ch
Date created:10-Jul-2002
Date available:06-Aug-2002

 

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