FU Berlin Digitale Dissertation
Cornelia Toepfer : Heterologe Expression einer funktionellen Domäne des nikotinischen Acetylcholinrezeptors Heterologous expression of a functional domain of the nicotinic acetylcholine receptor
|Zusammenfassung| |Inhaltsverzeichnis| |Ergänzende Angaben|

Zusammenfassung Um die Funktion von ligandengesteuerten Ionenkanälen besser verstehen zu können, muss ihre Struktur in einer Auflösung im Bereich von wenigen Å bekannt sein. Da es sich bei diesen Rezeptoren um sehr komplexe Membranproteine handelt, war eine Kristallisation und anschließende Röntgenstrukturanalyse bisher nicht möglich. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit ein anderer Ansatz verfolgt, die Struktur des nikotinischen Acetylcholinrezeptors weiter aufzuklären. Die intrazellulären Domänen der alpha-, beta-, gamma- und delta-Untereinheiten des Rezeptors aus Torpedo californica und des alpha7-Rezeptors aus Ratte sollten in verschiedenen Systemen exprimiert werden, um die Struktur dieser Domänen untersuchen zu können. Eine Untersuchung der intrazellulären Domänen ist für die Neurochemie unter anderem deshalb von Bedeutung, weil ihre Beteiligung an der intrazellulären Signalweitergabe wahrscheinlich ist. Bisher gibt es über alle Bereiche des Acetylcholinrezeptors Daten oder zumindest Modelle zu ihrer Struktur, es ist aber noch nichts über die intrazellulären Schleifen bekannt. Diese Schleifen besitzen bei einigen Untereinheiten Phosphorylierungsstellen, und durch Mutationsexperimente wurde ihre Wichtigkeit für das Clustering des Acetylcholinrezeptors an der postsynaptischen Membran gezeigt. Als eukaryontisches Expressionssystem wurde die Sf9-Insektenzellkultur verwendet. Einerseits über das Baculovirus-System, andererseits über direkte Transfektion wurden verschiedene DNA-Konstrukte in die Zellen gebracht. Die Baculovirus-Expression war für die Herstellung der gesuchten Proteine nicht geeignet, weil die Insektenzellen zu schnell starben, um ausreichende Mengen zu exprimieren. Außerdem sind die Prozeduren zur Herstellung der Baculoviren zu zeitaufwendig, um eine größere Zahl von DNA-Konstrukten für die Optimierung der Proteinexpression zu testen. Eine stabil transfizierte Zelllinie, die die intrazelluläre Schleife der delta-Untereinheit exprimiert, wurde etabliert. Mit diesen Zellen wurde eine Reinigungsprozedur für das exprimierte Protein ausgearbeitet. Diese Methode kann weiter optimiert werden, um ausreichende Mengen des gesuchten Proteins zu erhalten. Desweiteren wurden mehrere DNA-Konstrukte für verschiedene Fusionsproteine im prokaryontischen Expressionssystem E. coli versucht zu exprimieren. Von den intrazellulären Schleifen der delta- und der alpha7-Untereinheit wurden trunkierte Versionen in unterschiedliche Vektoren eingebracht. Für einige der Konstrukte konnte eine gute Expression erreicht werden, allerdings ließ sich das Protein meist nicht ohne Verwendung von hohen Konzentrationen an Detergenz aufreinigen. Das GST-Fusionsprotein der alpha7-Schleife konnte schließlich aus Bakterien mit einer Konzentration von 30 µg/ml isoliert werden. Als weitere Methode wurde die zellfreie Expression mit zwei In vitro-Systemen der Firmen Roche und RiNA getestet. Es wurden mehrere Expressionsversuche mit verschiedenen intrazellulären Schleifen durchgeführt. In einem Ansatz konnte erfolgreich die intrazelluläre delta-Schleife in kleiner Menge exprimiert und durch Ni2+-Affinitätschromatographie angereichert werden. Die Ausführungen zeigen, dass die Expression in zellfreien Systemen insbesondere von problematischen Proteinen für weitere Untersuchungen parallel zu anderen Expressions-Methoden in Betracht zu ziehen ist. Um für Strukturuntersuchungen ausreichende Proteinmengen der intrazellulären Domänen des nAChR zu erhalten, sind die in der vorliegenden Arbeit gezeigten Methoden entsprechend weiter zu optimieren.

Inhaltsverzeichnis Die gesamte Dissertation können Sie als gezippten tar-File oder als zip-File laden. Durch Anklicken der Kapitelüberschriften können Sie das Kapitel in PDF-Format laden: 0 Titelblatt und Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1.1 Synaptische Signaltransduktion 1.2 Struktur des nikotinischen Acetylcholinrezeptors 1.3 Bisher bekannte Teilstrukturen von anderen Ionenkanälen 1.4 Aufgabenstellung: Untersuchung der Struktur einer Proteindomäne 2 Ergebnisse 2.1 Nachweis der erfolgreichen Expression der intrazellulären Domäne 2.2 Expression in Insektenzellen 2.3 Expression in Escherichia coli 2.4 Expression in zellfreien Systemen 3 Diskussion der Ergebnisse 3.1 Expression in Sf9-Insektenzellen 3.2 Expression in E. coli 3.3 In vitro-Expression 3.4 Ausblick 4 Zusammenfassung 5 Summary 6 Material und Methoden 6.1 Methoden zur Proteinbestimmung 6.2 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 6.3 Western Blot 6.4 Molekularbiologische Methoden 6.5 Proteinexpression in E. coli 6.6 Zellkultur von Sf9-Insektenzellen 6.7 Indirekte Immunfluoreszenz von transfizierten Zellen 6.8 Membranpräparation aus transfizierten Zellen 6.9 Reinigung von exprimierten Proteinen 6.10 In vitro-Expression 6.11 Massenspektrometrische Analyse von Peptiden 6.12 Peptidsequenzierung nach Edman 6.13 Materialien 7 Literaturverzeichnis 8 Anhang 8.1 Vektorkarten und verwendete Sequenzen 8.2 MALDI-Komplettspektrum 8.3 MALDI-PSD-Spektrum 8.4 Abkürzungen und Einheiten 8.5 Eigene Veröffentlichungen 8.6 Lebenslauf 8.7 Danksagung

Ergänzende Angaben:
Online-Adresse:	http://www.diss.fu-berlin.de/2002/203/index.html
Sprache:	Deutsch
Keywords:	expression system, domain, acetylcholine receptor
DNB-Sachgruppe:	30 Chemie
Datum der Disputation:	12-Sep-2002
Entstanden am:	Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie, Freie Universität Berlin
Erster Gutachter:	Prof. Dr. Ferdinand Hucho
Zweiter Gutachter:	Prof. Dr. Werner Reutter
Kontakt (Verfasser):	connimgp@chemie.fu-berlin.de
Kontakt (Betreuer):	hucho@chemie.fu-berlin.de
Abgabedatum:	02-Oct-2002
Freigabedatum:	02-Oct-2002

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