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1.EINLEITUNG 1
1.1 Bakterielle Konjugation 1
1.2 Das promiskuitive IncPa-Plasmid RP4 2
1.3 Der konjugative DNA-Transfer des Plasmides RP4 4
1.3.1 Die Rolle von TraG-ähnlichen Proteinen in der Konjugation 7
1.3.2 TrbB ist Mitglied der PulE-Superfamilie 9
1.4 Aufgabenstellung 12
2. MATERIALIEN 15
2.1 Plasmide 15
2.2 Bakterienstämme 17
2.3 Bakteriophagen 17
2.4 Medien 17
2.5 Chemikalien, Proteine und Nukleinsäuren 18
2.6 Puffer 19
2.7 Sonstige Materialien 20
3.METHODEN 21
3.1 DNA-Techniken 21
3.1.1 Isolierung von DNA 21
3.1.2 Allgemeine in vitro-Rekombinationstechniken 21
3.1.3 Herstellung einer trbB-in frame-Deletionsmutante 22
3.1.4 Erzeugung von trbB-Punktmutationen 23
3.1.5 DNA-Sequenzierung 23
3.1.6 Herstellung von 32P-markierten ds-DNA-Fragmenten 23
3.2 Konjugation 24
3.3 Elektrophoresetechniken 24
3.3.1 Elektrophoresetechniken zur Auftrennung von DNA 24
3.3.2 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese 25
3.4 Proteinanalyse 25
3.4.1 Proteinüberproduktion durch induzierte Genexpression 25
3.4.2 Denaturierender analytischer Zellaufschluß 26
3.4.3 Nativer analytischer Zellaufschluß 26
3.4.4 Proteinreinigung 26
3.4.5 Quantitative Proteinbestimmung 27
3.4.6 Transfer von Proteinen auf eine Trägermembran 27
3.4.7 Immunologischer Nachweis von Proteinen (SOPHIA) 27
3.4.8 Protein-Sequenzierung 28
3.5 Elektronenmikroskopie 28
3.6 Glyceringradientenzentrifugation 28
3.7 Bestimmung der NTPase-Aktivität 28
3.8 Fragmentretentionstest zur Analyse von DNA-Protein-Komplexen 29
3.9 Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen 29
4.ERGEBNISSE 31
Teil 1 Die TraG-ähnlichen Proteine interagieren mit Komponenten des Relaxosoms
4.1 Ein Sequenzvergleich der TraG-ähnlichen Proteine legt die Unter-teilung in zwei Unterfamilien
nahe 31
4.2 RP4 TraG und F TraD ließen sich nach Modifizierung reinigen 33
4.2.1 Die N-terminale Modifizierung von RP4 TraG und F TraD beeinträchtigte nicht die Transferfunktion
der Proteine 33
4.2.2 Affinitätschromatographie mit Ni-NTA ergab gereinigtes His6-TraG und His6-TraD 35
4.3 His6-TraG und His6-TraD besitzen keine ATPase-Aktivität 37
4.4 His6-TraG und His6-TraD binden nicht-sequenzspezifisch an dsDNA und ssDNA 40
4.5 His6-TraG bindet an die Relaxase von RP4 und His6-TraD an R1 TraM 43
Teil 2 RP4 TrbB, R388 TrwD und cag HP0525 von Helicobacter pylori besitzen
strukturelle und enzymatische Gemeinsamkeiten
4.6 TrbB ist eine für die Konjugation von RP4 essentielle, enzymatische Komponente des
Mpf-Komplexes 47
4.6.1 Die Gene trbB und trbC sind translational gekoppelt 48
4.7 Die Reinigung von RP4 TrbB, R388 TrwD und cag HP0525 erfolgte unter nativen Bedingungen 49
4.7.1 Die Überexpression von RP4 trbB, R388 trwD und cag HP0525 in E. coli führte zur Überproduktion
von löslichem Protein, das in vivo aktiv war 49
4.7.2 Eine dreistufige Reinigung führte zu nahezu homogenen RP4 TrbB, R388 TrwD und cag HP0525 51
4.8 RP4 TrbB, R388 TrwD und cag HP0525 sind NTP-Hydrolasen 53
4.8.1 dATP, GTP und ATP sind Substrate für RP4 TrbB 53
4.8.2 Die NTPase-Aktivität von RP4 TrbB besitzt zwei pH-Maxima 54
4.8.3 Das Substratspektrum der NTPase-Aktivität von RP4 TrbB und R388 TrwD unterscheidet sich
vom cag HP0525-Substratpektrum 54
4.9 RP4 TrbB, R388 TrwD und cag HP0525 besitzen eine ähnliche hexamere Ringstruktur 55
4.9.1 Physikalische Eigenschaften von RP4 TrbB und cag HP0525 55
4.9.2 RP4 TrbB und cag HP0525 bilden Hexamere 57
4.9.3 Die oligomeren Strukturen von RP4 TrbB, R388 TrwD und cag HP0525 sind ringförmig 57
4.9.4 Die Hexamere von RP4 TrbB und cag HP0525 bestehen aus unregelmäßig trigonalen Untereinheiten 58
4.10 trbB-Mutationsanalyse von innerhalb der PulE-Superfamilie konservierten Bereichen 60
4.10.1 Die intakte Typ A-NBS in TrbB ist für den konjugativen Transfer von RP4 essentiell 61
4.10.2 Eigenschaften der TrbB-Mutantenproteine 61
5.DISKUSSION 65
5.1 Die TraG-ähnlichen Proteine bilden eine neue Proteinklasse, deren Funktion auf die Konjugation
beschränkt zu sein scheint 65
5.2 Die Rolle der Proteine der PulE-Superfamilie innerhalb der Assemblierung des Membrankomplexes 70
6.LITERATURVERZEICHNIS 75
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