FU Berlin Digitale Dissertation
Christina Maria Nock : Vom Genom zum Proteom: Genetische und Physikalische Kartierung von Gehirnproteinen der Maus From Genome to Proteome: Genetic and physical mapping of mouse brain proteins
|Zusammenfassung| |Inhaltsverzeichnis| |Ergänzende Angaben|

Zusammenfassung ZUSAMMENFASSUNG Mit der Totalsequenzierung des Genoms eines Organismus und der Identifizierung der kodierenden Sequenzen kann - im Prinzip - jedes Protein des betreffenden Organismus seinem Strukturgen zugeordnet werden, wenn genuegend Information ueber die Primaerstruktur (Aminosaeuresequenz, Peptidmassen) der Proteine vorliegt. Ungeklaert dabei bleibt jedoch, inwieweit ein Protein ueber sein Strukturgen hinaus von anderen kodierenden DNA-Sequenzen abhaengig ist. Das sind Gene, die auf die Modifikation und Expression der Proteine Einfluss nehmen koennen. Unter dieser Fragestellung wurde in der vorliegenden Arbeit mit genetischen Methoden eine umfangreiche Kartierung von Proteinen der Maus durchgefuehrt. Die Untersuchung der Gehirnproteine der beiden Maeusespezies Mus musculus und Mus spretus durch hochaufloesende zweidimensionale Elektrophorese (2-DE) in der Arbeitsgruppe Prof. J. Klose (Klose 1999b) hatte zum Nachweis von 1324 qualitativen oder quantitativen Proteinpolymorphismen innerhalb einer Gesamtzahl von etwa 8700 Proteinspots gefuehrt. Im Rahmen einer europaeischen Kooperation (The European Collaborative Interspecific Backcross; EUCIB) wurde mit den Maeusespezies Mus musculus und Mus spretus eine Feinkartierung des Genoms der Maus auf der Basis von DNA-Polymorphismen von etwa 1000 Rueckkreuzungstieren durchgefuehrt. Die durchschnittliche Markerdichte betrug 0.61cM. Die Kartierung von 1324 Proteinpolymorphismen auf der genetischen Karte der Maus in dieser Arbeit basierte auf den Ergebnissen der Analyse der Polymorphismen in 2D-Gelen von 64 Rueckkreuzungstieren der EUCIB-Kreuzung. Da viele der 64 Rueckkreuzungstiere innerhalb des EUCIB-Projektes nur unzureichend mit Mikrosatellitenmarkern genotypisiert worden waren, wurden in dieser Arbeit zunaechst IRS-PCR-Marker eingesetzt, um die Markerdichte zu erhoehen. Dies diente dazu, die Rekombinationen in den 64 Rueckkreuzungstieren vollstaendig zu erfassen und fuer die Proteinkartierung nutzbar zu machen. IRS-PCR-Marker sind Marker, die ohne jede Sequenzinformation eingesetzt werden koennen. Sie werden mit einem einzigen Primer, hier dem Primer B1R fuer das repetitive SINE-Element B1 der Maus, gewonnen. IRS-PCR-Produkte von genomischer DNA von Mus musculus, die einen quantitativen Polymorphismus zwischen Mus musculus und Mus spretus aufwiesen, wurden zur Genotypisierung von bis zu 300 Rueckkreuzungstieren der EUCIB-Rueckkreuzung verwendet. Die Integration von 70 IRS-PCR Markern und 9 Mikrosatellitenmarkern in das Ankermarkergeruest aus 90 DNA-Markern des EUCIB-Projektes bot ein dichtes Netz von Markern und damit eine wesentlich verbesserte Ausgangslage fuer die Positionierung der Proteine auf der genetischen Karte der Maus. Mit dem Programm MAPMAKER/EXP 3.0 wurde aus DNA- und Proteinpolymorphismen eine genetische Karte erstellt. Die Ergebnisse zeigten: Von 1324 polymorphen Proteinspots konnten 664 Spots genetisch kartiert werden. Spotserien, die gleiche Vererbung und gleichen Variationstyp zeigten, wurden unter demselben Variantennamen zusammengefasst und als 'homogene Spotfamilie' bezeichnet. Die 664 kartierten Spots stellen demnach 409 Varianten dar. Von diesen konnten 360 auf den Chromosomen positioniert oder zumindest Regionen zugeordnet werden. Als Grenzwert fuer die Anordnung der Proteine auf einem Chromosom galt ein LOD-Wert von 2,5. 49 Varianten zeigten nur geringe, jedoch signifikante Kopplung (LOD-Wert groesser 3) an einzelne Marker der Chromosomenenden und konnten daher zumindest einem Chromosom zugeordnet werden. Mit dem hier verwendeten genetischen Verfahren der Kartierung mendelnder Merkmale liessen sich nur monogen bedingte Polymorphismen kartieren. Die nicht positionierten, nur schwache Kopplung zeigenden 49 Varianten sowie die andere Haelfte (660 Spots) der 1324 Polymorphismen, die nicht zur Kartierung eingesetzt werden konnten, liessen sich offenbar deswegen nicht kartieren, weil diese Proteine polygen determiniert waren. Die Polymorphismen dieser Spots werden vermutlich von mehr als nur einem - dem Strukturgenlocus - determiniert. Um herauszufinden, welche Proteine die 664 kartierten Spots oder 409 Varianten darstellen, bestand der zweite Schritt nach der Kartierung in der Identifizierung der kartierten Proteinspots durch Massenspektrometrie. Das Ziel hierbei war, Spotfamilien zu erkennen, d.h. die Isoformen eines Proteins zu finden. Insgesamt wurden bisher etwa 200 polymorphe Proteinspots identifiziert. Neben den genannten homogenen Spotfamilien konnten bisher 25 heterogenen Spotfamilien gefunden werden. Eine heterogene Spotfamilie enthaelt Spots, die als dasselbe Protein identifiziert wurden, aber unterschiedliche Polymorphismen aufweisen. Die genetische Analyse zeigte, dass einige der polymorphen Spots auf die genetische Position des identifizierten Strukturgenortes kartierten, waehrend andere polymorphe Spots auf einen anderen chromosomalen Locus kartieren. Diese Kartierungspositionen zeigen offenbar Protein-modifizierende oder -regulierende Gene an. Die identifizierten Proteine konnten folgenden Gruppen zugeordnet werden: 103 Proteinspots gehoerten 70 Proteinen an und erwiesen sich als neue Kartierungen in der Maus. 20 Proteine waren bereits kartiert worden und unsere Kartierung stimmte mit der bekannten Kartierungsposition ueberein. Diese Proteinpolymorphismen wurden als Strukturgen-bedingte Polymorphismen gewertet. Sie beruhen auf verschiedenen Allelen des Gens in den beiden Mausstaemmen. Eine dritte Klasse bildeten 21 Polymorphismen, die abweichend von der bisher bekannten Kartierungsposition in der Maus oder der des menschlichen Orthologs kartierten. Zum Beispiel gehoeren Spots der heterogenen Spotfamilie des Proteins 'Gamma-Enolase' zu allen drei genannten Klassen: vier Mobilitaets-Varianten kartieren auf die bekannte Position des Gens fuer Gamma-Enolase auf Chromosom 6, zwei auf weitere unterschiedliche Positionen auf Chromosom 6 und eine auf Chromosom 15, auch ein nicht-varianter Spots wurde identifiziert, der ein kleineres Molekulargewicht zeigt und wahrscheinlich ein Fragment darstellt, das die Mutation verloren hat. Auf Einzelspotebene sind 70% der mit Massenspektrometrie identifizierten polymorphen Spots strukturgenbedingt, waehrend 30% der Polymorphismen durch einen Modifikator- oder Regulatorgenort verursacht werden. In der vorliegenden Arbeit wurde die cytosolische Fraktion der Gehirnproteine untersucht. Zur weiteren Untersuchung liegt die Membranfraktion vor. Ferner wurden von den gleichen Rueckkreuzungstieren der EUCIB-Kreuzung auch die Organe Leber, Herz, Niere und Muskel entnommen. Die genetische Analyse wurde inzwischen auf die Organe Leber und Herz ausgeweitet. Die 2DE-Muster zeigten, dass viele Proteine in mehreren oder allen Organen auftreten. Die genetische Untersuchung dieser Proteine wird zeigen, ob der Effekt von Protein-modifizierenden und -regulierenden Genen wesentlich zur Organspezifitaet der Proteine beitraegt.

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EINLEITUNG.................................................................................1 1.1 Das Konzept einer Large-Scale Analyse in der Biologie......................................1 1.2 Funktionelle Genomanalyse..................................................................3 1.3 Proteomanalyse - die Wiederentdeckung der Proteine.........................................4 1.4 Proteomanalyse - Stand der Technik.........................................................7 1.4.1 Gelsysteme.................................................................................7 1.4.2 Proteinextraktion..........................................................................9 1.4.3 Quantitative Analyse von 2D-Mustern.......................................................10 1.4.4 Bildanalyse von 2D-Mustern................................................................10 1.4.5 Massenspektrometrie von Proteinen.........................................................11 1.5 Proteomanalyse im Vergleich zur Genomanalyse..............................................12 1.5.1 Methodische Aspekte.......................................................................12 1.5.2 Syntheserate und zelluläre Konzentration der Proteine.....................................13 1.5.3 Posttranslationale Modifikationen der Proteine............................................13 1.6 Die genetische Analyse als Bindeglied zwischen Genom und Proteom..........................15 1.6.1 Proteinpolymorphismen.....................................................................15 1.6.2 Das Netzwerk zwischen Gen- und Proteinebene...............................................17 1.7 Genetische und physikalische Kartierung von Proteinen der Maus Ansatzpunkte zur eigenen Untersuchung.....................................................18 1.7.1 Ein Europäisches Kollaborationsprojekt zur genetischen Kartierung der Maus(EUCIB).........18 1.7.2 Die physikalische Karte des Mausgenoms....................................................19 1.7.3 Ansatz und Ziele der eigenen Untersuchungen...............................................20 II. MATERIAL UND METHODEN.....................................................................22 2.1 Molekulargenetische Untersuchungen........................................................22 2.1.1 Material..................................................................................22 Enzyme....................................................................................22 Grössenstandards..........................................................................22 Oligonukleotide...........................................................................22 Gefässe...................................................................................23 DNA- und Protein-bindende Membranen.......................................................23 Geräte....................................................................................23 Puffer und Medien.........................................................................23 Klonbanken................................................................................24 2.1.2 Versuchstiere.............................................................................25 2.1.3 Methoden..................................................................................28 Mikrobiologische Methoden.................................................................28 Molekularbiologische Methoden.............................................................28 2.2 Biochemische Untersuchungen...............................................................34 2.2.1 Material..................................................................................34 Chemikalien...............................................................................34 Geräte....................................................................................34 Lösungen..................................................................................34 2.2.2 Versuchstiere.............................................................................35 2.2.3 Methoden..................................................................................35 Präparation von Gehirnen..................................................................35 Proteinextraktion.........................................................................35 2D-Elektrophorese.........................................................................36 Färbetechniken............................................................................36 Massenspektrometrie.......................................................................37 2.3 Erfassung der genetischen Daten aus 2D-Proteinmustern.....................................38 2.4 Genkartierung.............................................................................40 2.4.1 Zusammenstellen der Protein- und DNA-Segregationsdaten in Dateien.........................40 2.4.2 Berechnung der genetischen Karte..........................................................40 Untersuchung paarweiser Kopplung (two-point linkage)......................................41 Mehrpunkt-Analyse (multipoint analysis)...................................................41 Kontrollen................................................................................41 III. ERGEBNISSE................................................................................42 3.1 Segregationsanalyse von DNA-Polymorphismen................................................42 3.1.1 Bedeutung und Häufigkeit von DNA-Polymorphismen und ihre Darstellung mittels genetischer Marker: RFLP-Marker, SSLP-Marker und IRS-PCR-Marker...........................42 3.1.2 Vorgehensweise bei der Genotypisierung der B1-Mäuse durch IRS-PCR-Marker..................44 3.1.3 Kartierungsdaten der IRS-PCR-Marker.......................................................46 3.1.4 Datenqualität.............................................................................49 3.1.5 Einsatzmöglichkeiten der IRS-PCR Marker für andere Mäusekreuzungen........................51 3.1.6 Kartierungsdaten für Mikrosatellitenmarker................................................53 3.2 Segregationsanalyse von Protein-Polymorphismen - Ergebnisse aus 2D-Mustern................55 3.3 Eine genetische Karte aus DNA- und Proteinpolymorphismen..................................57 3.3.1 Vorbemerkung zur Genkartierung............................................................57 3.3.2 Genkartierungsdaten.......................................................................59 Der Ausgangspunkt der Kartierung: die Rahmenkarte (framework map).........................59 Erweiterung der Rahmenkarte mit IRS-PCR und Mikrosatellitenmarkern........................59 Integration von Proteindaten in das DNA-Marker Netzwerk...................................64 Integration der MSO-Marker des EUCIB Projektes in die genetische Karte....................65 3.3.3 Datenqualität.............................................................................66 3.3.4 Verteilung der kartierten Proteine auf die einzelnen Chromosomen - Vergleich mit der MBx-Datenbank........................................................66 Die Kartenlänge in Abhängigkeit von der Kartierungsfunktion...............................69 3.4 Identifizierung von genetisch kartierten Proteinspots durch Massenspektrometrie...........71 3.5 Physikalische Kartierung nichtpolymorpher Proteinspots von 2DE-Gelen......................77 3.5.1 Vorgehensweise............................................................................77 3.5.2 Proteinidentifizierung und Identifizierung eines entsprechenden cDNA-Klons................78 3.5.3 Kartierung von I.M.A.G.E cDNA-Klonen mittels IRS-PCR auf YAC-Klonen.......................80 Identifizierung von genomischen BAC-DNA-Klonen für IRS-PCR................................80 Herstellung der IRS-PCR Produkte von genomischen BAC-DNA Klonen...........................82 Hybridisierung von IRS-PCR Produkten der BACs gegen YAC-Klonbanken........................82 IV. DISKUSSION................................................................................89 4.1 Genetische Kartierung bei der Maus........................................................89 4.2 Markersysteme.............................................................................90 4.3 Die Beobachtung: Proteinspots eines 2DE-Musters zweier Mausstämmen zeigen Variationen.....92 4.3.1 Sind die Variationen der Proteinspots der Mäusestämme Mus spretus und Mus musculus genetisch bedingt?...........................................................92 4.3.2 Welche Variationstypen wurden gefunden und welchen Erbgängen folgen sie?..................93 4.3.3 Die molekulare Basis von genetischer Variation............................................95 4.3.4 Häufigkeit von Proteinpolymorphismen zwischen zwei Mäusespezies...........................96 4.3.5 Detektierbarkeit von Mutationen mittels 2D-Elektrophorese.................................97 Quantitative Variabilität der Proteine....................................................99 4.3.6 Praktische Anwendungen: Sind Proteinpolymorphismen als genetische Marker einsetzbar?.....100 4.4 Die Identifizierung kartierter, polymorpher Proteinspots mit MALDI Massenspektrometrie enthüllt abweichende Kartierungsergebnisse...............................................101 4.4.1 Die abweichende Kartierung des polymorphen Proteinspots mV147............................102 4.4.2 Die abweichende Kartierung des polymorphen Proteinspots paV410...........................103 Wie sicher ist unsere Kartierung: besteht Kopplung zu anderen Regionen des Genoms?.......104 4.4.3 Die abweichende Kartierung des polymorphen Proteinspots mV134............................105 Wie sicher ist unsere Kartierung: besteht Kopplung zu anderen Regionen des Genoms?.......105 4.4.4 Die abweichende Kartierung des polymorphen Proteinspots paV419...........................106 Wie sicher ist unsere Kartierung: besteht Kopplung zu anderen Regionen des Genoms?.......106 4.4.5 Die abweichende Kartierung des polymorphen Proteinspots aV19.............................108 Wie sicher ist unsere Kartierung: besteht Kopplung zu anderen Regionen des Genoms?.......108 4.4.6 Die abweichende Kartierung des polymorphen Proteinspots mV82.............................109 4.4.7 Die abweichende Kartierung des polymorphen Proteinspots mV248............................109 4.5 Zusammenfassend: Anwendungen der Proteinkartierungen.....................................110 4.5.1 Neukartierte Proteine als Kandidaten für Krankheitsloci..................................111 4.5.2 Proteinphenotypen - wer verursacht den Phänotyp?.........................................114 4.5.3 Identifizierung von variantem und nichtvariantem Spot des 2D-Gels........................115 4.5.4 Nichtkartierbare Proteinpolymorphismen...................................................117 4.6 Die Biologische Aussage der Kartierung von Interspezies-Polymorphismen...................119 Der Prozess der Artbildung...............................................................119 Die Auflösung der genetischen Karte - warum kartieren viele Proteine auf gleiche Positionen?..............................................................................120 Analyse der Spotgruppen identischer, genomischer Position hinsichtlich der Abschätzung der Anzahl verschiedener Proteine auf einem 2DE-Gel......................................122 4.7 cDNA-Kartierung - die physikalische Alternative..........................................124 V.Referenzen...............................................................................128 ANHANG Chromosomenkarten: Chromosom 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 und X der Maus Legende zu den Chromosomenkarten Tabelle1: Liste der polymorphen Proteinspost und Varianten in der cytosolischen Fraktion von Maus Gehirn. Kartierungsposition, Kopplungswahrscheinlichkeiten und genetische Abstände Legende zu Tabelle 1 Tabelle 2: Liste von polymorphen und nicht-polymorphen Spots, die zur selben Spotfamilien gehören, jedoch auf mehrere verschiedene Positionen der Mauschromosomen kartieren Veröffentlichte Arbeiten

Ergänzende Angaben:
Online-Adresse:	http://www.diss.fu-berlin.de/2002/151/index.html
Sprache:	Deutsch
Keywords:	proteomics, genetic mapping, mouse, two-dimensional electrophoresis, polymorphism, variant
DNB-Sachgruppe:	32 Biologie
Datum der Disputation:	11-Sep-2001
Entstanden am:	Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie, Freie Universität Berlin
Erster Gutachter:	Prof. Dr. Dr. Joachim Klose
Zweiter Gutachter:	Prof. Dr. Ferdinand Hucho
Kontakt (Verfasser):	Christina.M.Nock@gsk.com
Kontakt (Betreuer):	klose@charite.de
Abgabedatum:	12-Aug-2002
Freigabedatum:	27-Aug-2002

 

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